常用PCR技术基础知识(研究生课程).ppt

1、PCR基础知识,聚 合 酶 链 式 反 应,聚合酶链式反应（polumerase chain reaction，PCR） 是依赖于靶DNA序列侧翼上做结合的两个寡核苷酸引物 在体外由DNA聚合酶催化合成特异性DNA片段的方法。,体内DNA复制,体外DNA复制, 变性, 延 伸, 退 火,-,-,-,-,PCR扩增反应体系 模板DNA - 扩增起始底物 -影响扩增的特异性和产量 要求： 引 物 - 寡核苷酸片段 -决定PCR扩增的特异性和长度 要求：特异性好（特别是3端与模板配对） 长度适宜（一般以15bp30bp为宜） 碱基组成分布尽可能随机 引物自身或两条引物间无互补结构 聚 合 酶 - 耐

2、热DNA聚合酶-活性依赖金属离子 作用：有5-3链延伸活性（合成方向 5-3 ） 有5-3外切酶活性 (清楚 “阻碍物” ） 无3-5外切酶活性（错配率2.110-4） d N T P - 合成DNA的原料,PCR扩增反应过程 变性通过加热，使双链DNA模板解离成为单链 变性温度：由模板DNA双链的G+C含量决定 变性时间：由模板DNA分子的长度来决定 退火温度下降，引物与模板互补碱基结合成双链 温度计算：Tm = 4（G+C）+2（A+T) 温度设置：通常比溶解温度低3-5度 延伸适当温度，DNA聚合酶催化合成新的DNA链 最适温度：72-78 （ TaqDNA聚合酶 ） 合成速率：2000

3、bp/min,未知基因突变的筛查,PCR-单链构象多态性,原理：长度相同，但碱基组成顺序不同（甚至单个碱基不同）， 的DNA单链，非变性条件下形成的空间构象不同，在非 变性凝胶中的电泳迁移率不同而表现出的DNA多态性， 方法：,目的片段扩增,扩增产物变性,变性产物电泳,（single-strand conformation polymorphism，SSCP）,PCR扩增产物,变 性,非变性PAGE,A A,A C,C C,AA AC CC,注意事项： 扩增产物：片段长度400bp 限制酶酶切后在检测 扩增的特异性好 调整扩增体系或条件 变性处理：避免产物浓度高 合理稀释（1:4或1:6） 变

4、性完全且稳定 加样时在冰浴下进行 电泳条件：凝胶基质 T=8%-10%，C=1.3%-2.6% 0.4mm-0.4mm 添 加 剂 10%-15%的蔗糖或甘油 凝胶温度 不加甘油， 4-10 添加甘油，20-25,原理：同样长度但碱基序列不同的DNA片段其解链区域及各 解链区域的解链条件不同，因此它们在凝胶电泳分离 过程中，可在变性剂浓度不同的位置处发生部分解链 导致迁移速率大大下降，从而在凝胶中被区分开来。 方法：,PCR-变性梯度凝胶电泳,电泳分离,PCR扩增,用两个引物扩增基因组DNA 一条引物：5端有GC-Clamp,凝胶中变性剂呈线性梯度增加 变 性 剂：甲酰胺 或 尿素,变 性 剂

5、 梯 度,PCR扩增产物,主要优点： 检出率高：如果突变发生在最先接连的DNA区域 检出率可达100% 片段较长：最适检测片段长度为100-500bp 一般可以检测1000bp 注意事项： GC-Clamp：片段长度 30-40个GC组成 （可以借助计算机程序设定) 扩增产物：不宜用于G-C碱基较高（70%）基因突变筛查 （可选用SSCP方法进行筛选） 突变确定：DNA序列分析 (不能确定突变的位置和种类）,已知基因突变的检测,DNA序列多态性- DNA片段碱基种类差异构成的多态性 单个核苷酸的变异所致的DNA序列多态性 - 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorp

6、hism，SNP） 原因：碱基的替换（转换或颠换） 优点：1. 二等位基因 - 基因频率可以估算 2. 分 布 广 泛 - 人类基因组内约有3106个 3. 高 度 稳 定 - 特别是编码区的SNP 4. 影 响 产 物 - 编码区的SNP可影响蛋白质表达 5. 易 自 动 化 - 提高工作效率,PCR-RFLP（限制性片段长度多态性-PCR）,原理：不同等位基因的限制性内切酶位点分布不同，其PCR 扩增产物用特定限制性内切酶消化后产生的片段的数 目和长度不同，形成的电泳谱型不同。 方法：,-C- -C- -T- -C- -T- -T-,扩增产物,酶切片段,电泳分离,- - - - - -,H

7、ha（GCGC）,CC CT TT,结果判定,序 列 特 异 性 引 物 - PCR,原理：在一定条件下，PCR引物3末端的错配导致产物的急剧减 少，针对不同的已知突变，设计适当的引物，可以通过 PCR扩增直接达到区分突变型和野生型的目的。 特点：需要三条引物，根据扩增产物的有无判定基因型,A A C C G G C T G G A A C C T T T T,反应体系1,反应体系2,DNA chip（DNA芯片技术）,概念：DNA芯片技术是指同时处理分析大量DNA片段的技术， 可用于基因诊断、基因制图、基因表达DNA序列分析。 特点：操作简单、自动化程度高、检测效率高 应用范围广、成本相对较低 原理：DNA分子杂交技术,1.载体固定寡核苷酸探针,2.靶DNA扩增产物杂交,3.杂交信号检测,G,A,TT,CC,TC,C C G G C T G G A A C C,短串联重复序列（short tandem rep