曲霉菌检测技术要点及Troubleshooting

1、,曲霉菌抗原检测试剂盒技术要点,郭芳岑 产品经理 伯乐生命医学产品（上海）有限公司,曲霉菌抗原检测试剂盒,基本技术介绍,曲霉菌抗原检测试剂盒,包装规格：96T/Kit 试剂盒组成：微孔板、 浓缩清洗液、 阴性对照血清、 cut-off质控血清、 阳性对照血清、 酶标结合物、 样本处理液、 TMB溶液、 终止液、 微板密封板、 说明书等。,曲霉菌试剂盒基本原理,目的 采用酶联免疫双抗体夹心一步法（ELISA）半定量检测人血清样本中半乳甘露聚糖抗原，用于对侵袭性曲霉菌感染高危患者的筛查诊断，动态疗效监测及临床用药的评估 原理 采用双抗体夹心ELISA方法检测血清样本中的半乳甘露聚糖抗原。微板中包被

2、半乳甘露聚糖抗体，可与样本中半乳甘露聚糖抗原和试剂中酶标抗体试剂结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。通过酶标仪检测吸光度（OD值），经公式计算得到I值（GM指数），根据GMI与cut-off值（0.5）的比较判断有无曲霉菌的感染或感染的程度,所需仪器或材料,（1） 实验室台式离心机：1.5mL聚丙烯试管，能获得10,000g的离心加速度 （2） 加热块，或水浴设备（温度为100 ） （3） 微孔板孵育器371 （4） 全自动或半自动微孔板洗板机 （5） 备有450nm和620/630nm滤光片的酶标仪,曲霉菌操作流程,1.处理对照血清和患者样本（血清/BAL）:

3、 300ul +100ul R7,2. 扣紧试管盖，120加热6分钟（heater）,3. 扣紧试管盖，100加热3分钟（水浴）,4. 10,000g 离心10分钟,曲霉菌操作流程,4.准备记录表，以区分对照和患者得到样本（不同微孔）,5. 每孔加入50ul R6（酶结合物）,6. 每孔加入50ul处理好的样本上清（对照或患者）,7. 用封板膜将96孔板封好后，置于37孵育90分钟,曲霉菌操作流程,8.准备洗液：将稀释液R2按照1:20比例用去离子水稀释,9. 用洗液抽吸洗涤5次,10. 每孔快速加入200ul显色剂TMB溶液（R9），注意避光,11. 室温（18-25）避光，孵育30分钟（不

4、封膜）,曲霉菌操作流程,12.每孔加入100ul终止液（R10），小心擦拭96孔板底部,13. 在450/620nm波长下读取OD值。加入终止液后需在30分钟内完成读数,14. 样本中GM抗原的结果通过计算GMI（GM指数）确定：,样本记录表,Step 4 准备一份可以识别微孔板上受检血清和对照血清的图表。用其中一孔作为阴性对照血清使用（R3），两孔作为Cut-off对照血清（R4），一孔用于阳性对照血清（R5）。,R31.5,临床GM检测流程,曲霉菌抗原检测试剂盒,操作注意事项及技术要点,实验室工作流程,患者准备,样本采集,样本检测,报告签发,报告应用,如何保证检测质量？,曲霉菌的特点,霉菌

5、的分布 占空气中真菌的12% 来源于百度百科 空气中真菌前三甲： Cladosporium：37% Non-sporing：22.5% Yeast：18.3% 灰尘中真菌前三甲： Yeast：50.6% Cladosporium：17% Aspergillus:12% 来源于现代医药卫生2007年第23卷第9期1409 最适宜生长温度25-30,曲霉菌的检测首要重视环境问题,以下工作应在超净台内完成： 试剂盒和耗材拆包装及密封 样本取样并加处理液,实验前准备,打开超净台 75%酒精擦拭洁净台桌面及内壁 紫外灯消毒15分钟以上，操作前关闭紫外灯 记号笔（防水） 离心管架 加样槽,实验操作步骤及注

6、意要点,在使用前，将试剂从冰箱冷藏室取出平衡30分钟至室温后方可使用,样本处理,超净台内操作 洁净的耗材 加样枪的正确操作,做好标记，防止结果无法对应,耗材的洁净要求,无热原 消毒无热原 无尘 超净台内开包装 超净台内密封后移出,正确使用加样枪,定期校准 垂直操作 枪头要卡紧 慢吸快打 吸一档打二档或吸一档加样后反复吹打 不建议吸二档打一档 枪头不要再次使用,加热,注意孵育时间和温度 猜我喜欢哪个？,Recommendation,Heat Block的一点小问题,对小离心管的要求,不要太紧 不要太松 无尘无热原,离心,离心时“配平”是基本常识 注意转速和时间 注意换算 公式：G=1.1110-

7、5Rrpm2 G：离心力 R：离心半径（单位：厘米） rpm：转速 例： 如离心机为10cm离心半径，则Rpm应为9492 如离心机为15cm离心半径，则Rpm应为6328,样本布局,注意加样位置 理解ELISA实验的“边缘效应”,加酶结合物,排枪不如你想象那么好用 使用前做好检查 使用要点同单枪 排枪使用需要加样槽 加样槽要洁净，每次用后要及时清洗。,加样,注意节奏 你会质疑自己是不是“老花眼”,孵育,孵育时要盖密封条 震荡混匀要小心 拆掉密封条要小心,配制洗液,注意配制比例 纯水要使用新鲜制取 不要舍不得用R2 要冲洗管路 管路会有残留 瓶子会有挂壁,洗板,不要过于相信机器 管路是否洁净

8、加样是否都加满 吸样是否都吸尽 我的习惯 最后一次吸样结束后拍一拍 不要挑战“拍力”的极限,加显色剂,注意这个词：Rapidly 回顾一下： 排枪使用加样槽 注意：绝对不要同加酶结合物的加样槽混用。 如果实在要用，要确保酶结合物不会混进TMB溶液中。,显色孵育,不覆盖封板膜 温度要求：室温 最重要的一点： 避光,终止,注意按照TMB的加样顺序 尽量保持同TMB加样的节奏,读数,注意在终止后30分钟内读数 双波长（ 450/620nm ）读数 读数前用吸水纸擦干酶联板底部 如果对读数有疑问，可以用白纸铺底看小孔内的颜色 读数值越高，则颜色越黄 如果孔内为蓝色，需要补加终止液 隐约可见蓝色，可能是

9、终止液加入未混匀。,结果,准确的结果： 优质的试剂 正确的操作 良好的仪器,曲霉菌抗原检测试剂盒,Trouble shooting,曲霉菌抗原检测试剂盒-Troubleshooting Guide,曲霉菌抗原检测试剂盒-Troubleshooting Guide,曲霉菌抗原检测试剂盒-Troubleshooting Guide,曲霉菌抗原检测试剂盒-Troubleshooting Guide,曲霉菌抗原检测试剂盒-Troubleshooting Guide,曲霉菌抗原检测试剂盒-Troubleshooting Guide,曲霉菌抗原检测试剂盒-Troubleshooting Guide,曲霉菌抗原检测试剂盒-Troubleshooting Guide,曲霉菌抗原检测试剂盒-Troubleshooting Guide,曲霉菌抗原检测试剂盒-Troubleshooting