血液生化自动分析仪

1、 临床生物化学自动化分析技术 第一节 自动生化分析仪发展概况 自动化仪器的定义：由机械化的仪器设备取代人的手工操作过程，具有信息反馈、自我监控、自我调节功能的仪器设备。 1957年泰克尼康公司按Skeggs医师的设计方案，生产了第一台单通道连续流动式自动生化分析仪，最初只用于血葡萄糖、尿素氮的检测，结果以光密度值报告。 1964年，Skeggs有报道了能够同时测定多个项目的自动生化分析仪。 随后，泰克尼康公司生产出多通道自动分析仪系列，20世纪70年代中期又研制出SMAC,该仪器由计算机控制，分析速度可达150份标本/h，同时测定20个项目。 第二节 自动生化分析仪工作原理1、 自动生化分析仪

2、的分类 按反应装置的结构可分为：连续流动式 离心式 分立式 “袋”式 按自动化程度 ：全自动 半自动 按同时可测定的项目 ：但通道 多通道 按复杂程度及功能 ：小型 中型 大型 按试剂反应方式 ：湿化学 干化学按反应装置的结构分类法最常用1. 连续流动式自动生化分析仪 特点：流动室主要基于“气泡隔离连续分析”原理，将相同测定项目的样本与试剂混合后在同一管道中完成化学反应的测定过程。在检测过程中，样品盒样品之间需要空气精心隔离，或用空白试剂或者是缓冲液来隔离。前者叫空气分段式系统，后者为非分段式系统。 工作过程：（1）通过比例泵将标本和时间按比例地吸到连续的管道系统中，在管道系统呢样本和时间相结

3、合完成混合、分离、保温反应、显色、比色的步骤。（2）将所测得的吸光度变化作计算，讲测试结果显示并打印输出。2. 离心式自动生化分析仪 特点：将样本和试剂房子特制的圆盘内，圆盘放在离心机上作为转头，在离心作用下完成混合、反应和测定。圆盘上有呈现放射状的三个一组的孔，起着里边一个孔加试剂，中间孔加样品，最外边孔的的上下表明用透明塑料制成，其做比色孔。 转盘转动后，内孔中的试剂和中间孔的样品首先混合，最后进入外孔。单色光是按垂直方向通过比色孔进行比色测定，然后将所测得的吸光度进行计算，并显示与打印测试结果。3. 分立式自动生化分析仪 目前国内外多采用的设计模式，具有结构简单和检测速度快的特点。 特点

4、：模仿是宏观操作，用加样探针讲样本加入各自的比色杯中，试剂探针按一定的时间要求自动的定量加入时间，经搅拌器混匀后，在一定的条件下反应。反应后将其抽入流的比色器中进行测定，或直接将特制的反应呗作为比色器进行比色测定。4. 干化学自动生化分析仪 采用干化学方法，将发生在液相反应物中的反应，专业到一个固相载体上，利用风检测系统进行检测的医疗新型仪器。2、 自动生化分析仪的基本结构 基本结构：样本系统 反应系统 清洗系统 光路检测系统 计算机控制系统1. 样本系统 样品盘或传送轨道 加液器 试剂室2. 反应系统 包括比色杯 混合装置 恒温装置 3. 给排水及清洗系统4. 光路检测系统 包括光源灯 分光

5、装置 信号检测装置5. 计算机控制系统3、 自动生化分析仪的基本原理1. 可见、紫外分光光度法 定量分析基础是朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律。公式为：A=CL。其中吸光度A=（I/I0）,I0为入射光强度，I为出射光强的，L为比色池厚度。如果浓度以mol/L为单位，液层厚度单位为cm，表示摩尔消光系数。其意义是1摩尔浓度的溶液在厚度为1cm是的吸光度。不同物质的摩尔消光系数不同，值越大，表示该物质对某波长的吸收能力越强。可见影响吸光度的主要因素有3种，及浓度、光程及波长。在光程及波长都不变的情况下，吸光度就只与浓度有光。及物质在一定波长的吸光度与它的吸收介质的厚度和吸光物质的浓度呈

6、正比。 朗伯-比尔定律应用条件（1） 入射光需单色光，因为物质对不同波长的光有不同的吸光系数。（2） 一般适用于稀溶液的测定（3） 介质应均匀，介质不均会引起偏离2. 免疫比浊测定法 比浊通过检测悬浮液或者胶乳溶液中物质对光的散射或透视强度。常用的免疫比浊法是采用某种蛋白特定的抗体作为试剂，能在复制的蛋白混合物中对该蛋白进行检测，又分为投射比浊和散射比浊。 目前应用较多的为免疫透射比浊法。主要用于血清特种蛋白的检测，如载脂蛋白、微量蛋白、急性时相反应蛋白、免疫球蛋白等，以及某些药物监测。 一般比浊法德灵敏度不然可见、紫外分光光度法，但是免疫比浊法的灵敏度达到纳克水平，晚期能够满足临床检测需要。

7、3. 均相酶免疫分析法 此法利用免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性对抗原或抗体进行检测的一种分析方法。原理：当酶标志物与相应的抗原或抗体结合生成酶标抗原抗体复合物后，对标记酶产生调节作用，使酶的构象改变，酶活性机制或增强，酶催化的信号随之发生改变；酶标抗原抗体复合物与游离酶标抗原同处一相，不需分离步骤就可测定酶的活性，计算出被检抗原（半抗原）的含量。 目前主要用于检测小分子半抗原，如某些激素、药物或带些产物，现在也逐渐用于大分子物质，如血清IgG测定。4. 酶促反应法 由酶催化的反应称为酶促反应，酶促反应以酶作为试剂来进行分析测定，或通过酶促反省测定待测酶的活性，具有高效、专一、温和、

8、灵敏的特点，广泛用于生化分析。 血液中的酶含量甚微，一般每毫升含量在微微克到豪微克水平，因此要直接测定酶含量是非常困难的。目前临床仍以测定酶活性间接推算酶的含量。酶活性的大型，是在一定条件下，通过测定酶促反应中单位时间内底物的减少量或产物的生成量引起的吸光度变化，及测定酶促反应的速率来获得的。 四、自动生化分析仪的基本测定方法1. 终点法 终点分析法是基于反应达到平衡时反应产物的吸收光谱特征及其对光吸收强度的大小，对物质进行定量分析的一类方法，它是实验室最常用的方法之一。（1） 一点法：一点法是当样品试剂混合后，待测物与试剂的物理化学反应达到终点时，测定吸光度，计算待测物的浓度。以样品和试剂混

9、合之前的空气空白（GB）、水空白（WB）或试剂空白（RB）的吸光度读书减去空白读数，得到反应吸光度、。通过与相同条件下校准液反应吸光度的比较，求得测定结果。（2） 两点终点法：也称固定时间法，可以用一种或两种试剂。以样品和试剂混合之后的某一时间点作为始点，以反应终点的习惯的读数减去始点读数。 优点：可以消除样品、试剂的颜色、浊度，以及一些干扰物质对测定的干扰。若使用单试剂，在样品和时间混合后的延滞期后读取A1，一定时间后读取A2，A=A2-A1,然后比较标准和测定的A值，求得待测物的浓度。2. 连续监测法 目前酶学真的得一种主要方法，该法通过从多个点连续测定酶促反应过程中产物浓度的增加或底物浓

10、度的建设随时间变化的数据，求出酶促反应的初速度，间接计算酶活性浓度。是一种在反应中连续监测反应过程，根据所测定的产物生成或底物消耗的速度进行地定量分析的方法。该法于定时法德主要区别不需停止酶促反应，也不想添加任何显色剂就可测定反应物浓度的变化。 （1） 连续监测法：即零级反应速率法，亦称斜率法。在零级反应期内，每隔一定时间（常为230s）读取1次吸光度值，至少读取4点，得到3个A；然后通过计算机将得到的数据作最小二乘法处理，求出单位时间内的反应速率A/min。此法必须以零级反应为测定计算的基础，因为只有在零级反应下，单位时间内的吸光度变化（反应速率A/min）才与酶活力呈正比。（2） 两点速率

11、法：即所谓一级速率法。在反应中选取来那个时间点t1、t2，读取吸光度A1、A2，通过(A2-A1)/(t2-t1)计算A。它与连续检测法比较，缺点在于人为确定t1、t2，不定因素较多，不能保证反应在t1-t2期间呈线性，影响结果准确性；应在常规测定前，先做预实验来确定线性时间段。 优点在于方法简单，酶活力较低、测定吸光度值较小时，可增加测定时间段而不受仪器连续监测时间点的局限，减少读数误差。（3） 速率B法：在1个通道内1次进行2项反应相关的速率法测定。它既可以是2项实验测定，也可用于干扰反应或作为样品空白的自动补偿。干扰反应或作为样品空白的自动补偿的基本原理是通过仪器的微机自动处理系统，在第

12、一反应（干扰反应）一直维持线性的前提下，从第二反应（主反应）速率中如用于扣除第一反应速率的延续影响。实际工作中如用于消除胆红素转化为胆绿素后吸光度下降，对肌酐苦味酸法测定的负干扰。3. 空白校正在分光光度法中，常利用空白溶液来调节仪器的吸光度零点，或用来抵消某些测定的干扰因素。在生化分析仪测定中，除了采用双或多波长、两点法等排除背景干扰外，常要运用专门空白测定，以便从样品测定吸光度中扣除其影响。正确选择空白校正，对提高准确度起重要作用。（1） 试剂空白：一般在方法类型和校准模式中，即分为有或无时间空白两大类。（2） 样品空白：主要为了消除样品本身浑浊或色度的干扰。4. 单试剂法 在反应过程中仅

13、加1次试剂的方法 （1）单试剂单波长法：只在选定的温度和某一特定的波长，读取反应一定时间时的吸光度的方法。 （2）单试剂双波长法：主要为了消除检测体系或标本的浑浊而设置，自动生化仪大部分终点分析均用此法。 （3）标本空白法：该法适用但波长或双波长均可，当适用双波长还记着不良浑浊、色素、脂血等带来的影响时，常用本法来做终点分析。 5.双试剂法 此法可消除一些干扰和非特异性反应，特别当试剂不稳定时，要分开配置和加入反应系统，以确保检测结果的准确。 （1）双试剂单波长一点法 （2）双试剂二点法 （3）双试剂双波长法 6.双波长法 第三节 自动生化分析仪性能及评价1、 自动生化分析仪性能评价指标 1.

14、 精密度评价 （1） 批内重复性（2） 总精密度（3） 与厂商骨架的精密度或临床要求的精密度比较，讲计算好的批内精密度和总精密度用2检验法进行比较，若所计算的2值小于表中的2，则说明所测精密度与厂商估计值物显著性差异。2. 相关性 3. 波长校正2、 自动生化分析仪的选择与应用1. 自动化程度 指仪器能够独立完成生化检测操作程序的能力。2. 分析效率 指在测定方法相同的情况下自动生化分析仪的分析速度。3. 应用范围 包括仪器所能进行的分析方法以及可测定项目的种类，应用范围与仪器的设计原理及结构有关。4. 精度与准确度5. 其他性能 仪器的取液量 最小反应液体积和测试速度等 第四节 干化学分析技

15、术1、 干化学仪器的类型及特点 按检测样品分类：全血干化学分析仪和血浆（血清）干化学分析仪 按检测项目的多少分类：单项 双项 三项 四项 多项 2、 干化学试剂载体的基本结构 双层膜结构 三层膜结构 多层膜结构 3、 干化学测定的基本原理 干化学测定主要是反射光度法和差示点位法4、 干化学分析的应用及发展前景 目前，越来越多的项目都采用干化学分析，例如干式尿液分析仪、便携式血糖仪、干化学分析仪等。干化学分析简便、快捷、准确的优点特别适合急诊标本的检测。 干化学分析的成本较高，某些系统的检测项目优先，这些因素都一定程度上限制了其应用范围。一旦解决了这些问题，干化学技术将会有更好的应用前景。 第五

16、节 实验室信息系统与全实验室自动化1、 实验室信息系统 指对患者检验申请、标本识别、结果报告、质量控制和样本结果分析等各个方面数据进行管理的信息系统。1. 实验室信息系统的体系结构（1） 检验服务器（2） 医嘱服务器（3） 实验室信息系统工作站（4） 医师工作站（5） 护士工作站2. 实验室信息系统的功能 帮助实验室工作人员对日常业务的处理，以及实验室管理者了解日常业务一遍试试有效的控制、组织、计划等。3. 实验室信息系统的安全性（1） 完备的安全预防措施（2） 软件的安全防护措施（3） 完善的操作过程 荧光免疫技术及应用荧光免疫技术（fluorescence immunoassay ,FIA

17、）是将抗原抗体反应与荧光技术相结合，具有高特异性和高敏感性的免疫标记技术。1、 荧光免疫技术基本原理（一）荧光显微技术荧光素标记抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原结合，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织切片或细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。1. 直接标记法 荧光素标记抗体与相应抗原特异性结合，洗涤后荧光显微镜下观察特异性荧光以检测未知抗原。常用于病原体检测和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。2. 间接标记法 未标记荧光素的特异性抗体（第一抗体）与相应抗原反应，再用荧光素标记的第二抗体与抗原抗体复合物中的第一抗体反应

18、，洗涤后荧光显微镜下观察特异性荧光以检测未知抗原或抗体。常用于血液和体液中自身抗体的检测。3. 双标记法 两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，与同一组织或细胞抗原反应，洗涤后荧光显微镜下观察特异性荧光，当存在两种相应的抗原，则可见到两种颜色的荧光。该方法同时检测同一标本内的两种抗原。（2） 荧光免疫测定技术 常用的荧光免疫测定技术主要有流式细胞分析技术、时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫测定和荧光酶免疫测定等。 二、技术要点 荧光免疫显微技术 荧光素、荧光素标记抗体、荧光显微镜是荧光免疫显微技术的基本要素1. 荧光素常用的荧光物质有：（1） 异硫氰酸荧光素（FITC）最大吸收光波长为490

19、495nm，最大发射光波长520530nm，可呈明亮的黄绿色荧光，是应用最广泛的荧光素。（2） 四乙基罗丹明（RB200）最大吸收光波长570nm，最大发射光波长595600nm，呈橘红色荧光。可与FITC的翠绿色荧光形成鲜明的对比，常用于双重标记或对比染色。（3） 四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）最大吸收光波长550nm，最大发射光波长620nm，呈橙红色荧光。（4） 藻红蛋白 最大吸收光波长5655nm，最大发射光波长578nm，可与FITC一起用于双色免疫荧光染色。2. 荧光技术相关概念（1） 荧光效率：指荧光物质将吸收的光能转变成为荧光的百分率。在一定范围内，荧光强度与激发光强度呈正

20、相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的激发光会使荧光很快褪去。（2） 荧光寿命：指荧光物质被一瞬间脉冲激发后尝试的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。（3） 荧光猝灭：指荧光物质在某些理化因素作用下使荧光减弱的现象，包括物理因素，如紫外线照射、高温，和化学因素，如苯胺、酚、间苯二酚、硝基苯、溴化物、碘化物和Cl-,Fe3+，Ag+等。荧光免疫技术中可使用猝灭剂消除不需要的荧光，常用的荧光猝灭物质有亚甲蓝、碱性复红、伊文思蓝以及低浓度的过锰酸钾和碘溶液等。3. 荧光抗体的制备 通过搅拌标记法或透析标记法将荧光素与特异性抗体结合，采用透析法或凝胶过滤法纯化标记抗体，制备高荧光素/蛋白质结合比率

21、、高抗体效价的荧光抗体，并尽量保证抗体的特异性。4. 标本的制备 标本制作过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中抗原应尽量不发生溶解和变相，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中去。标本切片要求尽量薄，以利抗原抗体接触和镜检。常见的临床标本主要有：组织、细胞和细菌三大类。不同标本可制作成涂片、印片或切片，组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片。石蜡切片应操作繁琐、结果不稳定、非特异反应强等原因已很少在荧光显微镜技术中应用。组织材料也可制成印片，细胞或细菌一般制成涂片，要求薄而均匀。5. 荧光显微镜检测 荧光抗体染色的标本需在荧光显微镜下观察。荧光显微镜是荧光显微技术的基本工具。其主要机构与普通光学显微镜基本相同，但不同之处在于光源、滤板、不吸收紫外线的聚光器和镜头等，根据光路可分为透射光及落射光两种形式。荧光显微镜检查要求选择好光源和滤光片。一般观察FITC标记物可选用激发滤光片BG12，配以吸收滤光片OG4或GG9；观察RB200标记物时，可选用BG12与OG5。6. 荧光强度的影响因素 （1） 激发光源：荧光强度与激发光强度成正比，增加激发光强度可提高荧光分