简述真核生物断裂基因在大肠杆菌表达的基本实验步骤

1、简述真核生物断裂基因在大肠杆菌表达的基本实验步骤真核基因在大肠杆菌中的表达形式一般可分为3 类: ( 1) 细胞内不溶性表达, 即以包涵体形式存在;( 2) 细胞内可溶性表达; ( 3) 蛋白分泌型表达。下面分别予以讨论:1. 细胞内不溶性表达细胞内表达的最大问题就是形成不溶性的包涵体, 包涵体是细菌表达的蛋白质在胞内互相凝集而形成的无活性固体颗粒, 具有很强的折光性。其形成的原因有: 目的基因的过度表达, 使蛋白质无足够时间进行肽链折叠, 产生凝集; 种种原因引起的蛋白质不能正确折叠; 蛋白质的性质及温度、pH 值等环境条件的影响等。近年来基于蛋白质折叠理论的研究, 普遍认为, 许多蛋白质的

2、天然构象并不是自发地一步折叠而成, 而是在一些辅助蛋白的协助下经许多中间态逐步形成。包涵体的形成, 是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态之间的特异性错误聚合, 而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。包涵体的形成对表达产物的活性不利, 但却有利于蛋白质的纯化。1. 1包涵体的分离: 为了获得包涵体, 常采用机械法破碎菌体, 如高压均质机和超声波破碎, 也可加溶菌酶超声波相结合。菌体破碎后, 经洗涤、离心( 5 00020 000 r/ min, 15 min) 分离, 即得包涵体。1. 2包涵体的溶解: 通常采用变性剂。对绝大多数包涵体而言, 在pH8. 0 条件下, 68 mo l/ L 尿

3、素或58 mol / L 盐酸胍即可将其溶解。另外, 去垢剂、有机溶剂、碱性环境( pH 9. 0)也可使包涵体溶解。如包涵体中蛋白含两个以上二硫键, 则还需加入还原剂如2-巯基乙醇和2-巯基苏糖醇等, 使二硫键处于可逆断裂状态。1. 3重组蛋白的复性: 包涵体溶解后, 其结合的蛋白互相分离, 呈变性状态, 即所有的氢键、疏水键全被破坏, 但一级结构保持完好, 因此去除溶解剂时, 一部分蛋白可自动折叠成具有活性的正确构型, 这一过程即复性。目前复性方法主要有稀释法、透析法和层析法( 或超滤) 。对于具有二硫键的重组蛋白, 复性时还涉及到二硫键的正确重组。一般用空气中的氧气即可使还原型半胱氨酸残

4、基形成二硫键, 也可加入微量硫化物如2-巯基乙醇、氧化型和还原型谷胱甘肽, 促进正确二硫键的形成。2. 细胞内可溶性表达2. 1共表达分子伴侣和折叠酶: 为了克服包涵体的形成, 常用的策略是在表达外源基因的同时, 共表达分子伴侣和折叠酶。分子伴侣( Chapero nes) 是细胞内催化及维持其它蛋白正确构象的一类蛋白质分子, 它们识别、结合和稳定部分折叠的蛋白中间体, 避免不适当的分子间及分子内作用, 但并不催化二级结构形成。大肠杆菌的分子伴侣有GroES/ GroEL、Dnak/ DnaJ、SecB、PapD 等。与分子伴侣不同, 折叠酶具催化异构作用, 限制蛋白变性速率。氧化还原酶Dsb

5、B 及肽脯氨酰异构酶( PPlase) 催化大肠杆菌中x-pro 肽键的异构反应。非受体蛋白酪氨酸激酶在大肠杆菌中表达多形成包涵体。Caspers 等将酪氨酸激酶Csk、Fyn 或Lck 等非受体蛋白与DnaK、DnaJ、GrpE 或GroEL、GroES 等共表达, 得到了可溶蛋白。2. 2表达融合蛋白: 目的蛋白与具强亲和力配体的多肽或蛋白构成重组融合蛋白, 然后利用固定化亲和层析方法纯化该蛋白。C-MyC 表位抗原和同感生物素序列分别与目的蛋白基因融合后, 利用亲和层析分离纯化目的蛋白。金属亲和层析( IMAC) 基于固定化的金属离子与蛋白上供电子基团的亲和作用。半胱氨酸、组氨酸、色氨酸

6、和精氨酸侧链多用于IMAC 结合。单个组氨酸融合于LgG1k 重链, IMAC 一步纯化重组Fab 片段。McCoy 等还发现11 种不同的淋巴因子分别与thior tdox in 构成融合蛋白, 在低温下以溶解状态高水平表达, 其中几种融合蛋白具有天然蛋白的生物活性。此外, 还可通过改变发酵条件, 如降低发酵温度, 加入不能代谢的糖, 降低培养基的pH 值等等,来减少重组蛋白的聚集进而改善溶解性。3.蛋白分泌型表达: 蛋白分泌型表达又可根据表达场所的不同分为周质分泌表达和胞外分泌表达。3. 1周质分泌表达: 是通过将外源基因融合到编码原核蛋白的信号肽序列的下游而实现, 当蛋白质分泌到位于大肠

7、杆菌细胞内膜与细胞外膜之间的周质时, 信号肽可被信号肽酶切除, 而获得具有天然一级结构的产物。同时氧化性的周质间隙可以模拟真核细胞的内质网环境, 便于新生肽链折叠成天然结构, 从而获得具有完全生物活性的重组蛋白。此外, 一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中稳定性提高。周质分泌亦存在一些问题, 如表达量低, 仅占细菌总蛋白的0. 3% 4% ; 信号肽不被切割或不在特异位置切割等。3. 2胞外分泌表达: 重组蛋白分泌到胞外可以使二硫键正确折叠, 避免蛋白质在胞内聚集, 形成包涵体, 而且还可使重组蛋白的下游纯化较为简单, 便于大规模放大处理。目前, 使异源蛋白分泌到培养基的系统主要有A-溶血素( haemolysin A,HLy A ) 系统和细菌素释放蛋白( bacteriocin releasepr otein, BRP) 系统。HLyA 系统是将真核基因融合在HLyA 的N 端, 利用HLyA 能直接从胞内转运到胞外的特点, 将重组蛋白分泌到培养基中。陈燕等将胰岛素原基因融合到金黄色葡萄球菌蛋白A 的基因上, 构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体, 它能高效表达, 且有效地分泌表达产