实时荧光定量PCR的原理与应用.ppt

1、,第六章 第二节 实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR),提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR 原理 实时原理,常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检

2、测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,荧光PCR及特点,1、荧光PCR 就是在利用荧光信号检测整个PCR扩增过程，获得在线描述PCR过程动力学曲线。 实时荧光PCR带来的好处是熟悉传统方法的人所无法想象的!,2、特点,闭管方式进行，操作简便，杜绝了产物污染源 非平台期检验，重现性好 利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该CT值具有极好的重复性 扩增检测合二为一，降低了传统方法过多人为因素的影响，使检测的自动化水平大幅提高,实时荧光定量PCR原理定量原理,介绍三个概念： 扩增曲线、荧

3、光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线,实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值,荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信

4、号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Ct值（Threshold Cycle ）,C代表Cycle ，t代表threshold： PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长的拐点处附近。,Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。,相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图 （终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性),Ct值的特点： Ct值则极具重现性,Ct值的确定,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想

5、的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,Ct与初始模板的关系,固定循环数后，荧光信号与模板数成正比 固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量,实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线,标准曲线： 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Ct与起始模板量的对数呈反比关系。 PCR扩增过程中引入一系列起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，利用该系列模板

6、的Ct值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计算未知样品的起始模板浓度。,荧光定量标准曲线,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,实时荧光定量PCR原理 绝对定量,提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon,实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记,实时荧光定量PCR 方

7、法 - 以SYBR Green 法为例,SYBR Green,SYBR Green法工作机理,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),Tm,SYBR Green

8、 法 融解曲线分析,Cycle number,SYBR Green 法 定量原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少 Log模板DNA浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,SYBR Green 法 -PCR反应的建立,反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同,SYBR Green 法 应

9、用范围,起始模板的测定 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。,SYBR Green 法 优缺点,提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR法 标准样品,相对定量中的内标 内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,绝对

10、定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA,实时荧光定量PCR法 定量方法,绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）,实时荧光定量PCR法 绝对定量方法,实时荧光定量PCR法 TaqMan法举例,TaqMan法研究ERBB2 在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异,TaqMan法举例 标记探针,使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量,Fam标记目标基因探针 VIC标记看家基因探针,TaqMan法举例 材料准备,从正常乳腺组织中提取的总 RNA 从乳腺癌组织中提取的 总RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质

11、粒用于生成标准曲线 单双通道同时进行，独立分析 Controls no RNA：阴性对照 RNA + no reverse transcriptase：基因组对照,TaqMan法举例 癌症标记物表达,TaqMan法举例 实验结果 定量,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法举例 实验结果 定量分析,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies