实验二 琼脂糖凝胶电泳.ppt

1、实验二 琼脂糖凝胶电泳,1、教学目的与要求： 学习与掌握DNA电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分子量，及分离不同大小DNA片段。 2、实验原理： 电泳概念及种类 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素,原理,DNA 分子是两性电解质， 在高于其等电点的溶液（ pH8.0pH8.3 ）中 ，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离， DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。 电泳时DNA 分子颗粒在电场中通过凝胶介质而泳动。颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。,琼脂糖是从海藻中提取的、由D-和 L-半乳糖残基通过和糖苷键交替构成的线状聚合物。琼脂

2、糖链形成螺旋纤维，然后再聚合成半径为20-30nm的超螺旋结构。干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，加热煮沸变为澄清，室温冷却、凝聚，即成琼脂糖凝胶。,原理,琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。,凝胶浓度 DNA分子大小 DNA分子的构象 缓冲液 电泳电压,主要检测：分子量，含量及有无,影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移率的因素,DNA分子的大小,双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与其碱基数的常用对数成反比。 分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。,DNA的构象,DNA的构象,不同构象DNA分子

3、在电场中移动的距离不同。具有相同分子量的线状、开环状和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度不同。 迁移速度： 超螺旋的DNA线状DNA 开环DNA 。,琼脂糖浓度,相同大小的线状 DNA片断在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同. 琼脂糖浓度(%)分离范围（kb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3,电泳电压,低压条件下，线状DNA在琼脂糖凝胶上泳动速度和电压成正比。随着电压升高，高分子量的DNA片段泳动速度和电压不成正比关系，分辩率下降了，因此为了得到良好的分离效果，电场电压不要超过5V/CM。,

4、缓冲液,DNA的泳动受缓冲液的组成和离子强度的影响。 最常用的缓冲也是TAE(Tris-醋酸-EDTA)和TBE(Tris-硼酸-EDTA)。,指示剂,常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度，也可以利用其迁移率大致估计DNA的分子量，而与琼脂糖浓度无关。,染色,溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物， EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。 EB是强致癌剂。,电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套),1、胶槽准备 取出胶板和梳子，将胶板放入胶槽中

5、; 将梳子垂直插入到胶槽的小凹槽内，梳齿底端和板面有1mm的间隙; 将胶槽放在调整好的水平台上。,2、凝胶准备 用1TAE配制1琼脂糖凝胶。 称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml 1TAE; 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖; 熔化的琼脂糖自然冷却到6070时，加入EB 0.5l，并轻轻混匀。,3、铺胶：将冷却致60的凝胶倒入准备好的胶槽内，凝胶厚度35mm,室温下静置半小时左右，凝胶固化。,4、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。将带凝胶的胶板置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可。,5、原梳齿处(样品孔)即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。,6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。,7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般5-7l。,9、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。,8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电