第一章 基因工程的分子生物学基础.ppt

1、第一章 基因工程的分子生物学基础,授 课 人：余春梅 授课学院: 南通大学生命科学学院,基因工程的概念,细胞外用各种方法产生的核酸分子插入载体分子中，形成遗传物质的新组合，最终整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。 遗传工程、基因操作、重组DNA技术等,基因工程诞生的理论基础,-证明了DNA是遗传物质 -双螺旋模型 - 遗传密码子的破译 1）不同的基因具有相同的物质基础 2）基因是可切割的 3）基因是可以转移的 4）多肽与基因之间存在对应关系 5）遗传密码是通用的 6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。,基因工程的技术基础,工具酶：DNA连接酶 内切酶 反转录酶 P

2、CR技术 载体技术 基因转移技术,第三节 基因工程中采用的主要酶类,一、序列特异的DNA限制性内切核酸酶,（一）限制性内切酶的发现 宿主细胞的限制和修饰作用,1 、宿主细胞的限制和修饰作用： 两种不同来源的入-噬菌体K； C，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株，C 株 ）。 当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但K 噬菌体在C株成功，由C株繁殖出K后代，能感染C株, 不能感染原来K株.,(二 )限制和修饰作用的分子机制,1大肠杆菌宿主细胞 K株，C株 ，有各自的限制和修饰系统。 1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS. 2）hsdR编码限制

3、性核酸内切酶-识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。 3）hsdM编码产物是DNA甲基化酶-催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。 4） hsdS表达产物的功能是-协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。,(二)、限制和修饰作用的分子机制,2. 入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，C株 中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点（修饰） 3当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解（限制） 4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降

4、解。,5但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但K噬菌体在C株成功，由C株繁殖出K 后代，能感染C株, 不能感染原来 K株) 6细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来DNA。 B株不能产生限制性内切酶，其它来源入-噬菌体可以感染B株，在B株繁殖，入-噬菌体则在 K株和 C株 受到严格的限制作用,(二) 限制和修饰作用的分子机制,(三) 限制性内切酶的分类,（四）限制性内切酶切割特点,1、识别位点 一般为4-8个bp的回文序列 大多数酶作用于底物DNA双链，位点在识别序列中或靠近识别序列 少数酶能作用于回文序列相应DNA单链序列,限制

5、性内切酶切割特异位点的机理,（四）限制性内切酶切割特点,平末端： 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成的DNA片段具有平末端。 黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。 5突出的黏性末端 3 突出的黏性末端,平末端的DNA片段不易重新环化,已知有两种不同的限制酶都可产生粘性末端：,5-P 端突出：,3-OH 端突出：,同尾酶,一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核酸内切限制酶。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-

6、5,同裂酶（isoschizomers）,有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。,限制酶识别与切割的靶点序列及其随后的连接同DNA的来源无关，即不带有种的特异性，对各种DNA普遍适用 。 根据这一特性，才能将不同来源的DNA片段重组成新的重组体分子或是新的基因。,从生物秀网站下载,二、连接酶,（一）DNA连接酶的作用模式,1、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成5，3磷酸二酯键的酶,5末端形成DNA腺苷酸复合物,（二） DNA连接酶的两种类型,类型 I：E. coli DNA 连接酶（只连接粘末端） 利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主

7、要来源于原核生物 类型 II：T4 DNA连接酶（粘末端和平末端） 利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也属于此类 在基因工程的实验中主要用T4 DNA连接酶,（三） 条件,（1）连接所需的条件 一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基（-OH），而在另一条DNA链的5末端具有一个磷酸基团（-P）； （2）需要有一种能源分子存在以提供羟基与磷酸基团之间形成磷酸二酯键时所需的能量。 大肠杆菌及其它细菌中：NAD+（氧化氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸） 动物细胞及噬菌体中： ATP,OH3,5P,（四）注意,被连接的两条DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分，DNA连接酶并不能连接两条

8、单DNA分子或环化的单链DNA分子。 DNA连接酶只能连接并封闭双螺旋DNA分子所出现的切口（Nick），即封闭双链DNA上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的断裂,GGTAC-OH P-C C-P HO-CATGG,5 3,3 5,GG-OH P-CC CCATGG,5 3,3 5,GGTACC CCATGG,5 3,3 5,三、激酶及碱性磷酸酯酶,碱性磷酸酯酶：除去DNA 5磷酸的酶 激酶：在DNA或RNA的5羟基(OH)端进行磷酸化的酶（作用结果是添加磷酸，可用于核酸的末端标记）,四、DNA聚合酶和RNA聚合酶,DNA聚合酶（来自大肠杆菌） 功能：53 的聚合酶活性。53外切核酸

9、酶活性， 3 5外切核酸酶 利用：53 的聚合酶活性以及53外切核酸酶活性，切口平移,Taq DNA聚合酶（来自耐热细菌） 具有53 的聚合酶活性和3 5外切核酸酶，高度保真，产生平末端，不能进行TA克隆 测序酶：具有53 的聚合酶活性，但不具备3 5外切核酸酶的T7DNA聚合酶。 反转录酶：以RNA为模板合成DNA 的聚合酶,第四节 研究DNA和RNA的方法,一、核酸的分离纯化 通过各种方法将生物材料破碎，释放DNA（RNA）至溶液中，去除杂质（如用苯酚萃取蛋白质），再用乙醇沉淀核酸，通过离心，分离纯化核酸，最后用低浓度盐溶液溶解核酸。,1、细菌培养物的生长和收集 确定成分的培养基(defi

10、ned medium)，M9 不确定成分的培养基(undefined medium)， 如LB 蛋白胨：提供氨基酸和小的肽段 酵母提取物：提供氮源，糖类以及其它有机与无机营养,实例1：细菌DNA的提取,2、细胞提取物的制备 细菌细胞的屏障:细胞膜和细胞壁 物理方法与化学方法 化学方法: 溶菌酶(消化细胞壁多聚物) EDTA(螯合钙离子, 抑制DNA酶的活性) SDS:去污剂,协助细胞壁的裂解,实例1：细菌DNA的提取,3 从细胞提取物中纯化DNA 降解杂质,留下DNA(苯酚与氯仿的混合物,RNA酶) 离子交换层析,分离DNA(带正电荷的离子交换剂) 4 DNA取样的浓缩 乙醇沉淀(破坏了DNA

11、分子间的氢键) 5 DNA浓度的测量 A260/A280=1.8,实例1：细菌DNA的提取,植物叶片用液氮碾磨成细末后转移到1.5ml离心管 加650l 在65度预热的CTBA提取液 水浴锅中65温浴40分钟后取出，静置冷却 加入650l苯酚：氯仿（1：1）混合液，上下颠倒混匀，静置5分钟 12000rpm 离心10 分钟,实例2：植物DNA的提取,取上清液，加入2l（10mg/ml）Rnase,37 度水浴30分钟 再抽提一次 取上清液，加入2倍体积的冷乙醇或等体积的异丙醇 轻轻摇动，待发现有白色絮状沉淀，用牙签挑出或6000rpm离心5分钟 70%的乙醇洗后，凉干。,实例2：植物DNA的提

12、取,实例3 质粒DNA的制备,1 基于分子大小的分离 2 基于构象的分离 质粒有三种构型 cccDNA(共价闭环DNA)：DNA的两条链都是完整的。 ocDNA(开环DNA)：只有一条链是完整的。 线性DNA：DNA的两条链均被打开。多种细菌中存在线性的质粒DNA。但末端或是通过重复序列形成发卡结构或通过共价结合蛋白进行保护，避免核酸酶的降解。,碱变性 用CsCl-EB等密度离心,Ethidium bromide (EB),包含质粒的细胞,用溶菌酶弱化细胞壁，用NaOH和SDS溶液裂解,变性的染色体 DNA,用acidic sodium acetate 中和,染色体DNA复性 形成不溶的网状物

13、 高浓度的acidic sodium acetate使 protein-SDS 复合物和高分子量的RNA 沉淀,ccc DNA不发生变性，以天然状态溶解在溶液中,通过离心去除沉淀,通过乙醇或异丙醇浓缩沉淀，或用凝胶过滤方法纯化质粒DNA。,二、凝胶电泳,根据DNA或RNA 分子的大小，形状和拓扑结构，将DNA和RNA进行分离的技术。 DNA和RNA在胶上的迁移性 DNA或RNA分子带有负电荷，在胶支持物上向正电极运动 线性DNA分子根据大小进行分离，小分子比大分子要泳动快，所以能将DNA分子进行分离 环状DNA分子的移动受拓扑结构的影响。相同分子量的情况下，超螺旋线性缺刻或松散,二、凝胶电泳,

14、琼脂糖凝胶 是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。 琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定 凝胶孔径的大小 随着浓度的增加而变小，有效分离DNA大小范围为0.210Kb,DNA相对分子质量标准物,水平型平板电泳槽,二、凝胶电泳,聚丙烯胺凝胶 （acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。 凝胶孔径的大小决定于两者的总浓度以及比值 分辨率比较高，能区分12bp 差别的DNA/RNA分子，但只能分离几百bp的DNA/RNA分子,

15、三、 DNA测序,链终止法测序 化学降解法测序（自习） 自动化测序 非常规DNA测序（焦磷酸测序，芯片测序等）,1、链终止法测序技术路线与要求,制备单链模板 将单链模板与一小段引物退火 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列,A 克隆于质粒中DNA用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA,A 高酶活性 B 无53外切酶活性 C 无35外切酶活性,ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子连接的是氢原子,不是羟基,三、DNA测序,2、

16、自动测序 基本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.,制备单链模板 将单链模板与一小段引物退火 加入DNA多聚酶（4种脱氧核苷酸） 分别加入少量4种荧光标记的双脱氧核苷酸 将产物在一个泳道上电泳，根据不同片段的荧光信号判读序列,模板制备,PCR 反应（测序反应）,电泳,核酸序列阅读,2、自动测序,2、自动测序,第五节 膜印迹和核酸杂交,Southern 印迹,第五节 膜印迹和核酸杂交 So

17、uthern 印迹,大致过程如下： (1) 提取组织中的DNA，并用内切酶消化，进行琼脂糖凝胶电泳。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。 (3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置，以及信号的强度。,放射自显影核酸杂交过程 (photo film),Professor Sir Ed Southern, Whitley Professor of Biochemistry at the University of Oxford,.,School of l

18、ife sciences Nantong University,“Real” Southern blot (DNA-DNA blot),STAINED by Et Br,VIZUALIZED by P32,Southern 印迹的应用,限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP） RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性）。用于构建遗传图谱，分子诊断等 确定基因组中基因的拷贝数,Northern印迹的应用,Northern印迹（P17页） 检测基因的表达,Western 印迹,这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。 应用：蛋白表达量的检测，组织特异性蛋白定位的检测等,一抗,二抗,抗原,第六节 鉴定特定基因转录物的转录起点,对于转录的起始点、终止点和基因是否具有内含子等的研究 11.1.1电子显微镜分析核酸分子,