SDS凝胶电泳操作手册

1、 各项检验操作注意事项一. SDS-PAGE操作及注意事项1. 制胶 按如下配方制备分离胶和浓缩胶 4%浓缩胶（3ml） 10%分离胶（4ml）AB-30.25mL AB-6 0.8mL3gel buffer 0.75mL 1.335mL50%甘油(v/v) 0.64mLH2O 2mL 1.235mL10%APS(w/v) 22.5uL 20uLTEMED 2.25Ul 2uL注意事项：（1） 配制前先将两块玻璃板夹紧，可以先试漏。首先配置分离胶，用水封，静置40min后，将水吸干，再注入浓缩胶，插上梳子，注意要避免梳孔出现气泡。（2）在加入APS（10%过硫酸铵）和TENED后要尽快将胶注入

2、，防止其凝固后无法注入玻璃板内。2. 电泳注意事项：（1）制样：取40uL待测样，加入10uL5SDS PEGE loading buffer，混匀后煮沸10min（电磁炉1000W），制好的样放至室温后，放4保存，待电泳。（2）电泳：在电泳槽底部加入阳极缓冲液，将制好的胶连同装置放入电泳槽中，在两块胶之间注入阴极缓冲液。取2uL Marker注入胶孔中作为参照，再一次取5uL样品缓慢注入胶孔中，调整电压800-100V。待溴酚蓝从浓缩胶进入分离胶后，电压加至120-155V。继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源。小心撬开玻璃板，除去浓缩胶，取出分离胶，加入R250考马斯亮蓝染色40mi

3、n，再用脱色液脱色。3. 溶液的配制：（1）正极缓冲液Anode buffer(1)：12.114gTris加少量ddH2O溶解后，用HCL调PH至8.9，最后用容量瓶定容至500mL，4保存。（2）负极缓冲液 Cathode buffer (1)：6.057gTris+8.96gTricine+0.5SDS加入少量ddH2O溶解后，定容至500mL，4保存。（3）凝胶缓冲液Gel buffer (3)：36.342gTris+0.3gSDS加ddH2O定容至100mL，HCL调PH=8.45，过滤4保存。（4）AB-3：24g Acrylamide+0.75g Bis-acrylamide加

4、ddH2O溶解定容至50mL，过滤4保存。（5）AB-6：23.25gAcrylamide+1.5g Bis-acrylamide加ddH2O溶解定容至50mL，过滤4保存。（6）5SDS PAGE Loading buffer：分别取1.25mL1M Tris-HCL(PH6.8)，0.5Gsds,25mg溴酚蓝及2.5mL甘油，加纯水至5mL。注：Loading使用前加入巯基乙醇，1mL溶液加100uL巯基乙醇，室温下保存。（7）脱色液： 水：甲醇：冰醋酸=5:4:1（8）APS：10%过硫酸铵（9）R250考马斯亮蓝：500ml甲醇+400ml纯水+100ml冰醋酸，加入2.5g考马斯亮

5、蓝二. BCA法蛋白质浓度测定 操作步骤：将标准蛋白（1mg/mL）稀释成500ug/mL。在酶标板上取8孔，按如下加入溶液。将待测样品稀释到适合的浓度，加20uL在酶标空中，设重复。再每孔加入200uL AB工作液A:B=50:1。混匀后37保温30min。冷却至室温，在酶标仪上测各孔的A562值。使用excel绘制标准曲线，计算出待测样品浓度。 uL 1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白浓度（ug/mL）500 400 300 200 100 50 25 0BSA（500ug/mL） 20 16 12 8 4 2 1 0PBS 1 0 4 8 12 16 18 19 20三Bradford法蛋白浓度测定 操作步骤：在酶标板上取8孔，按如下加入溶液。将待测样品稀释到适合的浓度，加20uL在酶标空中，设重复。再每孔加入200uLBradford溶液，混匀后室温放置10min。在酶标仪上测各孔的A595值。使用excel绘制标准曲线，计算出待测样品浓度。uL 1 2 3 4 5 6 标准蛋白浓度（ug/mL）0 100 150 200 250 300BSA（500ug/mL） 0 2 3 4 5 6H2O 20 18 17 16 15 14 三. ELISA法测定EGF浓度操作步骤：1. 待测样品的稀释取10u