色谱分析技术在兽药残留及违禁添加物检测中的应用具体实例.ppt

1、色谱分析技术在兽药残留及违禁添加物检测中的应用具体实例,赵立军 四川省畜产品安全检测中心 2013年12月,国内检测方法的分类： 国家标准方法、地方标准方法、 行业标准方法、企业标准方法 . 检测方法标准的基本内容：,1.范围 2.规范性引用文件 3.原理 4.试剂和材料 5.仪器设备 6.试样的制备 7.测定步骤 8.结果计算 9.精密度 10.附录,1、样品提取2、样品净化3、上机测定4、结果计算,畜产品检测分析的一般步骤：,1. 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法高效液相色谱法,2. 可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱紫外检测法,3.蛋中苏丹红染料的检测方

2、法高效液相色谱法,4. 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定-高效液相色谱法,原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法高效液相色谱法（原文参见GB/T 22388-2008）2008-10-07发布 2008-10-07实施,1.1 方法原理 试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后， 用高效液相色谱测定，外标法定量。,1.2 样品处理 1.2.1提取 （1）液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等 称取2g（精确至0.01g）试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000 r/min离心10min。上清液

3、经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后做待净化液。,注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。,1.2.2 净化 阳离子固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg/3mL ，或性能相当者。使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化。 将待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。洗脱液于50下用氮气吹干，残留物用1mL流动相定容，涡旋混合1 min，过

4、微孔滤膜后，供HPLC测定。,a）色谱柱：C8柱，250 mm4.6 mm（i.d.），5m，或相当者； C18柱，250 mm4.6 mm（i.d.），5m，或相当者。 b) 流动相：C8柱，离子对试剂缓冲液-乙腈（85+15，体积比），混匀。 C18柱，离子对试剂缓冲液-乙腈（90+10，体积比），混匀。 c) 流速：1.0 mL/min。 d) 柱温：40。 e) 波长：240 nm。 f) 进样量：20 L。,1.3 高效液相色谱测定 HPLC 参考条件,1.4 标准曲线的绘制 用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80g/mL的标准工作液，浓度由低到

5、高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。 1.5 定量测定 待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。,1.6 结果计算 试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得： X,式中： X试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； A样液中三聚氰胺的峰面积； c标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）； V样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； As标准溶液中三聚氰胺的峰面积； m试样的质量，单位为克（g）； f稀释倍数。,1.7 空白实验 除不称取样品外，均按上述测定条件和步聚进行。 1.8 回收率及

6、方法定量限 在添加浓度2mg/kg10 mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间， 相对标准偏差小于10%。本方法的定量限为2mg/kg。 1.9 允许差 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。,2. 可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱紫外检测法（原文参见GB/T20764-2006）,1.1 方法原理 用0.1 molL Na2EDTA-Mcllvaine (pH40.05) 缓冲溶液提取可食动物肌肉（牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和兔肉）中四环素族抗生素残留，上清液用Oasis HLB或相当的固相萃取柱和羟酸型阳离子交换

7、柱净化，液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量。,由于四环素类抗生素在生物样品中易与蛋白质强烈结合，所以需用强酸或酸性脱蛋白剂从生物样品中提取。然而,在酸性条件下(pH2.0)，四环素类抗生素降解为脱水产物,加热时又可转变为差向异构体。因此，本方法选用含有0.1 molL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液作为提取溶剂。,1.2 样品处理 1.2.1提取 称取6 g试样，精确到0.01g，置于50mL具塞聚丙烯离心管中，加入30mL 0.1 molL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH4)，于液体混匀器上快速混合1 min，再用振荡器振荡 10min，以10 000rmin

8、离心10 min，上清液倒人另一离心管中，残渣中再加入20mL缓冲溶液，重复提取一次，合并上清液。,1.2.2净化 Oasis HLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前分别用5ml甲醇和10ml水预处理，保持柱体湿润。 阳离子交换柱：羧酸型，500mg，3mL。使用前用5ml乙酸乙酯预处理，保持柱体湿润。 将上清液倒入下接Oasis HLB固相萃取柱的贮液器中，上清液以3mLmin的流速通过固相萃取柱，待上清液完全流出后，用5mL甲醇 + 水（1+19）洗柱，弃去全部流出液。在65kPa的负压下，减压抽干40min，最后用15 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于100mL平底烧瓶中。

9、将上述洗脱液在减压情况下以3mLmin的流速通过羧酸型阳离子交换柱，待洗脱液全部流出后，用5mL甲醇洗柱，弃去全部流出液。在65 kPa负压下，减压抽干5min，再用4mL流动相洗脱，收集洗脱液于5mL样品管中，定容至4mL，供液相色谱-紫外检测器测定。,1.3 高效液相色谱测定 液相色谱条件 a) 色谱柱；Mightsil RP-18 GP，3m，150mm4.6 mm或相当者； b) 流动相：乙腈+甲醇+0.01 molL草酸溶液(2+1+7)； c) 流速：0.5 mLmin； d) 柱温：25； e) 检测波长：350nm； f) 进样量：60L。,1.4 标准曲线的绘制 用流动相将土

10、霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备液逐级稀释得到5、10、50、100、200ng/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。混合标准工作溶液当天配制。 1.5 定量测定 待测样液中各药物的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。,土霉素、四环素、金霉素、强力霉素参考保留时间见下表。,1.6 平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 1.7 空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。 1.8 结果计算,3. 蛋中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法 （原文参见GB/T19681-2005）,1.1 方法原

11、理 样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。 1.2 样品制备 将待测禽蛋在沸水中蒸煮10分钟，取出，冷却至室温。 将蛋皮剥开，弃去蛋白，蛋黄放入研钵中研磨均匀。将其倒入洁净的表面皿中，置于100烘箱中10小时，将其完全烘干。,1.3 提取 准确称取蛋黄1 g5g（准确至0.001g）样品于三角瓶中，加入10mL30mL正己烷，超声5min，过滤，用10mL正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，50下用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，待净化。 1.4 净化 层析用氧化铝（中性 100 目200 目）： 105 干燥 2h，于干燥器中

12、冷至室温，每100g 中加入2mL 水降活，混匀后密封，放置12h 后使用。 氧化铝层析柱：在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至3 cm 高，轻敲压实后加一薄层脱脂棉，用10mL 正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。,1.4 净化 将上述提取液慢慢加入氧化铝层析柱中，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。 控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于0.5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10mL30mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液

13、60mL洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL，经0.45m有机滤膜过滤后待测。,1.5 高效液相色谱测定条件,色谱柱： Zorbax SB-C18 3.5m 4.6mm150mm 流动相：溶剂A 0.1%甲酸的水溶液：乙腈 = 85：15 溶剂B 0.1%甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20 梯度洗脱：流速:1mL/min 柱温：30 检测波长：苏丹红 478nm ；苏丹红、苏丹红、苏丹红 520nm ； 于苏丹红出峰后切换。进样量10L。,1.6 标准曲线 吸取标准储备液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL，用正己烷定容至25mL，此标准系列浓度为0、0.16、0.32、0.6

14、4、1.28、2.56 g/mL，上机测定，据峰面积与浓度关系，绘制标准曲线。标准工作液及试样中苏丹红药物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。 1.7 结果计算 按公式（1）计算苏丹红含量： RCV/M （1） R样品中苏丹红含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； C由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）； V样液定容体积，单位为毫升（mL）； M样品质量，单位为克（g）。,实际操作过程中注意事项,（1）不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将1ug/mL 的苏丹红的混合标准溶液1mL 加到柱中，用5%

15、丙酮正己烷溶液60mL 完全洗脱为准，4 种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红、苏丹红的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏丹红的回收率偏低时表明活性偏高。 （2）皮蛋样品因碱性强，如果提取后过中性氧化小柱，回收率仅40% 左右。而在提取时加入一定量的醋酸，使其显中性，再同咸蛋样品的提取净化法，则可大大提高其回收率。,4.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定-高效液相色谱法（原文见GB/T 19857-2005）,1.1 方法原理 试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液 分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝

16、柱净化后，高效液相色谱-二氧化铅柱后衍生测定，外标法定量。,1.2 提取 称取5.00g样品于50mL离心管内，加入1.5mL 20%的盐酸羟胺溶液、2.5mL 1.0 mol/L的对甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10 000r/min的速度均质30s，加入10mL乙腈剧烈震摇30s。 加入5g酸性氧化铝，再次震荡30s。3 000 r/min离心10min。把上清液转移至装有10mL 水和2mL 二甘醇的100mL离心管中。然后在50mL离心管中加入10mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。,1.3 净化 在离心管中加入15mL 二氯甲烷，振荡10s，3 000 r/min

17、离心10min， 将二氯甲烷层转移至100mL的梨形瓶中，再用5mL乙腈、10mL 二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100mL梨形瓶中。45旋转蒸发至约1mL，用2.5mL乙腈溶解残渣。 酸性氧化铝柱：1g/3ml ,使用前用5ml乙活化。 将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤瓶两次，每次2.5mL, 把洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，45旋转蒸发至近干，残液准确用0.5mL乙腈溶解，过0.45m 滤膜，滤液供液相色谱测定。,1.4 高效液相色谱测定条件,a) 色谱柱： C18柱，250 mm 4.6mm（i

18、.d.）， 粒度5m，在C18色谱柱和检测器之间连接25%PbO2氧化柱； b) 流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液，梯度洗脱参数见下表； c) 流速：1.0 mL/min； d) 柱温：室温； e) 检测波长：618nm(孔雀石绿)； 588nm(结晶紫)； f) 进样量：50L。,1.5 液相色谱仪器测定 根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。 标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min、7.88min、17.77min、18.22min。,1.6 结果计算 按式（1）计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。 （1） 式中： X样品中待测组分残留量，mg/kg； C待测组分标准工作液的浓度，g/mL； A样品中待测组分的峰面积； V样液最终定容体积，mL； W最终样液所代表的试样量，g。,1.7方法检测限 本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为2.0g/kg。