Westernblot所需溶液的配制

1、.wb所需溶液的配制1 tris-甘氨酸电泳缓冲液 (running buffer) 5tris base15.14gglycine(甘氨酸)72.0gsds5.0g蒸馏水溶解至1000ml5tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g tris碱和72甘氨酸，5电泳级的sds，双蒸水定容至1l，ph值为8.3。使用前，将5稀释到1：取200ml 5，定容到1000ml。2 转膜缓冲液 （sending buffer）（现用现配）1000 ml1500 mlglycine(甘氨酸)14.413 g21.6 g1.0 m tris.hcl (ph8.3)25 ml37.5ml10% sds1 ml1.

2、5 ml甲醇 (methanol)200 ml300 ml蒸馏水溶解至1000 ml溶解至1500 ml 必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。小片段可不加sds。3 10% sds配置精品.电泳级十二烷基硫酸钠也叫sds（sodium dodecyl sulfate ，sds,c12h25o4nas）溶液: 10g sds，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调ph到7.2，室温保存。4 tris.hcl的配置1.0m tris.hcl (ph8.8)tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调ph到8.81.5 m tris.hcl (ph8.8)tris 45

3、.43 g 加入到250ml水中浓盐酸调ph到8.81.0 m tris.hcl (ph6.8)tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调ph到6.81.0 m tris.hcl (ph8.3)tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调ph到8.3，需要大约8毫升。注：tris的分子量是121.4. 4度储存。5 10% aps (ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。负20度

4、可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。6 10tbs (tris-buffered saline)的配置nacl80 g160 g精品.tris base24 g48 g双蒸水溶解至1000 ml溶解至2000 ml加hcl调ph到7.6，室温储存。7 tbst (tris-buffered saline with tween20) 的配置10tbs100 ml200 mltween201 ml2 ml双蒸水溶解至1000 ml溶解至2000 ml室温储存。8 上样缓冲液（loading buffer）的配置sds-page加样缓冲液:ph6.8 0.5mol/l tris缓冲液8ml，甘油6.4

5、ml，10%sds 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，h2o 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100g。9 stacking gel buffer (4)tris base: 0.5m5 ml 1m tris.hclsds(w/v): 0.4%0.4ml 1%sds调ph到6.8，加双蒸水到10毫升。精品.10 5sample buffer (10ml)stacking gel buffer5 mlsds1.0 g巯基乙醇2.5 ml（最后再加）甘油（glycerol）2.5 ml

6、溴芬兰（sigma b-8026）2.5 mg室温储存11 封闭液的配置 blocking solution 要用tbst配制牛奶5% (w/v) nonfat dried milk 或者1%bsa0.01% antifoam a (sigma)0.01%(v/v) sodium azide12 丽春红溶液：100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。1） 4%多聚甲醛（pfa）的配制 （1000毫升）40克多聚甲醛，加入800毫升水，60度搅拌溶解，加入300微升氢氧化钠，全部溶解后冷却到4度，再加入100毫升的10pbs，加水定容到1000毫升。调ph到7.2-7.4。通风

7、橱过滤，4度保存。13 组织裂解液精品.10mm tris- hcl (ph 7.4)48.44mg 粉末或1m tris- hcl 0.4ml150mm nacl350.6 mg1% tritonx-1000.4 ml 100%1% 去氧胆酸钠（sodium dexycholate）400 mg5mm edta74.4 mg 或0.25m edta 3.2 ml1% sds10% sds 0.4 mlpmsf (难溶解)7 mg蛋白酶抑制剂1片/10ml步骤：首先加10-20毫升的水溶解edta,再加入0.2%naoh使溶解，再调ph至 7.4；然后分别加入其他成分，溶解一个再加另外一个；去氧胆酸钠开盖后会飞出，应戴口罩。14. pbs的配制（1