第四章抗体多样性的产生

1、.,第六节ig的基因结构与ab多样性的产生,一、抗体学说的发展 二、ig的基因结构 三、ig基因重排和表达 四、抗体多样性的产生机制,.,根据抗原抗体反应的特异性，针对于某一种特定抗原，就会有特异的抗体与之相对应。也就是说，外界存在有多少种抗原，在体内就会产生相应的抗体。据估计，在人体内具有产生超过1亿种抗体的潜在能力。 如此多的抗体类型是如何产生的呢？,ab多样性和特异性是如何产生的？,抗体是如何产生的？ 预先储备抗原特异性 抗原诱导抗体特异性,抗体多样性的产生？ 一个基因编码一个蛋白 一个基因编码多个蛋白,上帝之谜：god（generationofdiversity ）,.,一、抗体学说的

2、发展,.,侧链学说 抗原诱导学说 直接模板学说 折叠学说 间接模板学说 选择学说 自然选择学说 克隆选择学说,一、抗体学说的发展,抗体形成机制的研究：,.,侧链学说（ 1897年， ehrlich ）,细胞具有多种膜侧链，毒素可以特异与相应侧链结合 细胞可产生多量而过剩的侧链，并将其释放的血液中，即成为抗体，这种游离的抗体，在血液中与毒素结合，便可将其中和，从而达到免疫效果。 一个细胞克隆具备针对多种抗原的多种膜侧链,一、抗体学说的发展,.,直接模板学说：抗原为模板合成抗体（1930年，breinl和haurowits） 前提：蛋白质的合成要以蛋白质为模板。 抗体的产生必需以抗原为模板，抗体的

3、抗原结合部位是以抗原决定簇为模板而形成的。 折叠学说：抗原诱导抗体折叠（1940年，pauling ） 所有抗体的初级结构完全相同，即氨基酸的排列顺序，其决定于基因。 球蛋白的高级结构取决于多肽链的折叠方式，高级结构决定抗体的特异性。 如在形成球蛋白处附着有抗原时，即球蛋白的高级结构即按抗原折叠，因而可使抗体获得特异性。,一、抗体学说的发展,.,间接模板学说：抗原对基因发生影响（1949年，burnet和fenner） 抗原进入细胞核中，干扰dna的合成，指导抗体的特异性。 抗原在细胞内继续存在，而且可随细胞而增殖，所以抗原不存在也能产生抗体。 对于自身与非自身的识别上，认为一切属于自身的物质

4、，均有自身的标记（self-marker），识别单位可以对其加以识别，因此对自身物质不能发生免疫反应。,一、抗体学说的发展,.,自然选择学说（1955年，jerne） 机体对任何抗原早已准备下了相似的抗体（自然抗体），外来的抗原如与某种自然抗体相对应时，便可与之结合。 抗原抗体复合物被巨噬细胞吞噬后，抗原被酶溶解，剩下的抗体便可在巨噬细胞内诱导产生与其具有同样特异性的抗体。 在抗体的形成上，起主要作用的是体内早已存在的抗体。这种抗体在特异性抗原的选择作用下，才能诱导吞噬细胞产生抗体。,一、抗体学说的发展,.,克隆选择学说（clone selective theory）,受到jerne的自然选择

5、学说的影响，澳大利亚免疫学家burnet毅然放弃其间接模板学说，并且引进了他在间接模板学说所主张的基因致使细胞特异性的概念 1957年发表了以“a modification of jerne theory of antibody production using the concept of clone selection”为题的论文。 1959年出版了题为the clonal selection theory of aquired immunity的专著，创立了举世闻名的克隆选择学说。,一、抗体学说的发展,.,克隆选择学说（clone selective theory）,基本思想 动物体内存

6、在大量的淋巴细胞克隆，每一克隆表面都带有特异性的sig。 抗原选择的不是游离的抗体，而是事先存在于淋巴细胞膜表面的抗原受体，即表面免疫球蛋白（sig）。 抗原能够选择性的激活带有相应受体的淋巴细胞克隆，使其分化增殖，产生相应抗体。 决定抗体结构的是淋巴细胞的基因，抗原不能改变修饰产生抗体的基因。,.,克隆选择学说（clone selective theory）,对抗体产生多样性的解释： 动物出生后，体内约有107个免疫细胞克隆，能产生各种抗体，足够抗原选择。 抗原与特异淋巴细胞的抗原受体结合，相应的克隆即被选择，进而增殖分化，产生抗体。 抗原的作用： 抗原的作用只是启动，与枪机的扳机相似。相应

7、的克隆一旦被选出，即便没有抗原的存在，也能继续产生抗体。 决定抗体特异性的是dna，抗原对其无影响,.,克隆选择学说（clone selective theory）,对免疫记忆现象的解释： 细胞克隆在分化过程中，一部分淋巴细胞停留在中间阶段，与再次同相应的抗体接触时，立刻发育成熟而产生抗体，呈现免疫记忆现象。 对免疫耐受现象的解释： 在胚胎后期，自身抗原已经齐备，于是凡能与自身抗原特异性结合的相应克隆，便可受到阻抑，最后被清除，构成自身免疫耐受。,.,取被卵白蛋白、牛血清蛋白免疫的a兔的淋巴细胞（能产生抗卵白蛋白、牛血清蛋白的抗体） 玻璃珠（附有牛血清蛋白）亲和淋巴细胞，收集非结合淋巴细胞。（

8、玻璃珠附有牛血清白蛋白，同产生抗牛血清白蛋白的b细胞克隆发生结合而清除；抗卵白蛋白的淋巴细胞未被清除） 用x射线处理b兔子，破坏骨髓，杀死原有的淋巴细胞；注入经玻璃珠处理的a兔淋巴细胞 卵白蛋白、牛血清蛋白免疫b兔，只产生抗卵白蛋白的抗体,克隆选择学说（clone selective theory）实验证据1： wigzell实验,.,a抗原偶联放射性元素，免疫动物，清除能与a抗原结合的淋巴细胞，不能分泌抗a抗体 识别其他抗原的细胞则不受影响，能产生抗体。,克隆选择学说（clone selective theory）实验证据2：humphrey放射自杀实验,a,产生抗a 及抗b抗体,抗原,a,

9、抗原,b,b,产生抗b抗体 不产生抗a抗体,+,+,.,结论,一、抗体学说的发展,抗体是如何产生的？ 预先储备抗原特异性 一个b细胞克隆对应一种抗体,抗体多样性的产生？ 一个基因编码一个蛋白 一个基因编码多个蛋白,未完待续,面对自然界中无穷无尽的抗原，就要求机体必须产生无限多的相应的特异性抗体与之针锋相对，但怎样才能使机体内为数不多的基因产生如此多的抗体呢？,.,二、ig的基因结构,以重链为重点,.,二、ig的基因结构,h基因库（重链基因连锁群）第14号染色体 基因库（链基因连锁群）第2号染色体 基因库（链基因连锁群）第22号染色体,（一）人类胚系ig基因及其定位,.,.,（二）人类胚系ig基

10、因结构,二、ig的基因结构,h链：包括v、d、j、c 基因片段。 c基因片段的排列顺序是：5-c- c- c3 -c1- c1- c2-c4-c-c2 -3 l(/)链：包括v、j、c 基因片段。,重链v区的基因由v、d、j三个基因片段组成 轻链v区基因由v、j两个基因片段组成。,.,h链的编码 v区： v、d、j基因编码 v基因：cdr1、cdr2 d基因及v-d：大部分cdr3 d-j基因：cdr3其余部分及骨架区 c区：c基因编码,了解,.,h链胚系基因结构,c区基因（ch）:9个,v区基因,v基因片段（vh）:65个,d基因片段（dh）:27个,j基因片段（jh）:6个,了解,.,三、

11、ig基因重排和表达,编码一条ig重链、轻链的基因是由胚系中多个分开的dna片段经剪切重排而成的。,.,ig基因表达的特点 （一）ig基因重排 （二）等位排斥与同种型排斥 （三）ig的类别转换 （四）分泌型和膜型ig （五）migm与migd的共表达,.,ig基因重排：ig胚系基因中，v、（d）、j基因片段之间由内含子隔开，通过基因片段的随机重排，形成v（d）j连接，再与基因片段连接，才能编码完整的ig多肽链。ig基因重排主要通过重组酶（recombinase）的作用实现。 ig胚系基因重排程序 首先是重链发生基因重排，随后是轻链重排。 重链：胚系基因 d-j连接 v-dj连接,三、ig基因重排

12、和表达,（一）ig基因重排,重点,.,三、ig基因重排和表达,.,等位排斥（allelic exclusion）：一条染色体上ig重链基因的有效重排，抑制另一条同源染色体重链基因重排。 b细胞中位于一对染色体上的轻链或重链基因，其中只有一条染色体上的基因得到表达。保证了一个b细胞只表达一种轻链和一种重链，也即只表达一种特异抗原受体。 同种型排斥（isotype exclusion）：是指两种轻链之间的排斥，轻链有链和链，但一个ig分子只能表达其中的一种，或是链，或是链。(注意：二者在非同源的染色体),三、ig基因重排和表达,（二）等位排斥与同种型排斥,.,类别转换（class switchin

13、g）：指b细胞在受抗原刺激后，首先合成igm，然后转为合成igg、iga和ige等的现象。由于ig的类型由重链决定，所以在重链重排时，在v区基因不变的情况下，c基因发生重排，使得最终的基因产物的v区相同，而c区不同；也就是说抗体识别的特异性相同，但ig分子的类型却发生了改变。,三、ig基因重排和表达,（三）ig的类别转换,重点,igg,ifn-,il-4,ige,il-5,iga,igm,b cell,抗原,举例,.,.,（三）ig的类别转换（图解）,cm,cd,cg3,v,j,cg3,d,v,j,d,v-d-j,cm,v-d-j,cg3,cm,cd,igm,igg,cm,cd,cg3,v,j

14、,d,v,j,cg3,d,dna,初始rna,mrna,dna重排,重排后dna,丢失的dna,rna选择剪切,.,ig的类别转换,.,比较ig基因重排与类别转换,三、ig基因重排和表达,.,三、ig基因重排和表达,（四）分泌型和膜型ig,igm 膜型(migm)：作为b细胞受体接受抗原信息，活化b细胞 分泌型(sigm) ：结合抗原，发挥免疫防御作用,产生机制：rna选择剪切,了解,.,rna选择剪切,.,幼稚b细胞的分化过程中，首先表达migm，后表达migd；migd是b细胞的重要表面标志。 b细胞若仅表达migm，在接受抗原刺激后易形成耐受性，若同时表达migm和migd，则受抗原刺激

15、后可被激活。故migd可作为b细胞分化发育成熟的标志，活化的b细胞或记忆b细胞的migd逐渐消失。,三、ig基因重排和表达,（五）migm与migd的共表达,了解,.,v-d-j,d,v-d-j,m,d,ploy a,ploy a,v-d-j,m,igd mrna,igm mrna,primary rna transcript,三、ig基因重排和表达,了解,产生机制：rna选择剪切,.,四、抗体多样性的产生机制,破解上帝之谜,.,1965年bennet首先提出“两个基因编码一条多肽链”假说，认为ig的v区和c区是由分隔存在的基因所编码，在淋巴细胞发育过程中这两个基因发生易位而重排在一起。 19

16、76年利根川进应用dna重组技术证实了这一假说。发现：编码一条ig多肽链的基因是由各个分隔开的dna片段经剪接重排而形成。,四、抗体多样性的产生机制,利根川进,因“发现抗体多样性的遗传学原理”而获1987年诺贝尔生理学或医学奖。,.,实验证据,.,编码ig基因的多样性（原始因素） 随机重排产生的多样性（主要因素） h 、l链的随机组合,四、抗体多样性的产生机制,vh: 40(v)25(d) 6(j)=6000 vl(k): 40(v)5(j)=200 vl(l): 30(v)4(j)= 120,1.9 106,抗体多样性机制,.,不准确连接、核苷酸插入 体细胞高频突变：b细胞在受到抗原剌激后，

17、已重排好的v区基因(尤cdr3)突变频率增高，称体细胞高频突变。经过抗原的选择，使v区cdr(互补决定区)与抗原的亲和力得到优化，即为抗体的亲和力成熟。,抗体多样性机制,四、抗体多样性的产生机制,+ n-核苷酸 +,tdt,.,重链基因的重排、rna处理和蛋白质表达的过程,.,ig(bcr) 多样性可达1014，tcr多样性可达1016,question：为什么有的人打乙肝疫苗却没有诱导出抗乙肝抗体？,.,.,第七节 抗体的制备,多克隆抗体 单克隆抗体 基因工程抗体,.,一、多克隆抗体（polyclonal antibody）， 第一代抗体 1.定义 指由不同b细胞克隆产生的针对抗原物质中多种

18、抗原决 定簇的多种抗体混合物。 如:免疫血清（含多种特异性、 抗体）。 2.特点 来源广泛，制备容易；特异性不高 3.实际意义 预防、治疗感染性疾病 如抗蛇毒血清、抗狂犬、破伤风血清等,多数天然抗原具有多种抗原决定簇,注入机体后可刺激多个b细胞克隆发生免疫应答,产生多种相应抗体-这种由多个克隆细胞产生的多种抗体混合物,即为多克隆抗体.,.,带有多个表位,针对不同表位的b细胞,克隆增殖,多种抗体的混合物 （多克隆抗体）,刺激小鼠,.,二、单克隆抗体（monoclonal antibody, mcab），第二代抗体,1.定义 由单一克隆b细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗

19、体。 2.特点 具有高度均一性。 3.杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞 无限增殖； 免疫b细胞 合成、分泌特异性抗体。 4.杂交瘤技术 hat培养基：次黄嘌(h), 氨基蝶呤(a)和胸腺嘧啶核苷(t)。,.,能否利用传统的抗体制备方法制备单克隆抗体？,方案1：利用生物化学的方法和手段从多克隆抗血清中分离具有单一抗原结合位点的抗体分子。,方案2：分离产生抗体的特异的b细胞克隆，并使之在体外条件下进行特异性抗体的合成。,.,cesar milstein nobel prize in 1984,georges kohler nobel prize in 1984,革命性的突破：杂交瘤技术,.,step1: 进

20、行杂交瘤细胞融合,单克隆抗体的制备原理和方法： (1) b细胞能产生抗体，但不易在体外培养 (2)骨髓瘤细胞能在体内、外无限增殖，但不能分泌抗体 (3) 两者形成的杂交瘤细胞即能大量增殖，又能合成和分泌特异性抗体。,.,hat筛选培养基的主要成分为： h：次黄嘌呤，dna合成底物 a：氨基喋呤，正常dna合成阻断剂 t：胸腺嘧啶，dna合成底物 由于氨基喋呤的作用，使dna合成的主要通路(叶酸途径)受阻，迫使细胞启动旁路通路进行dna的合成。如果细胞的次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(hgprt)或胸腺嘧啶激酶(tk) 缺失，无法启动旁路通路利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成dna，细胞死亡。,step2:

21、筛选杂交瘤,.,结果： hgprt或tk缺陷的骨髓瘤细胞在hat培养基中不能存活； 脾细胞不能在体外长期培养繁殖； 杂交瘤细胞从脾细胞获得hgprt或tk，可以存活。,.,将杂交瘤细胞克隆混合液充分稀释后加入每个小孔，最终使每个小孔中最多含有一个杂交瘤细胞克隆（单克隆） 用特异性抗原决定簇对每个孔的杂交瘤细胞克隆进行检测，选出针对目标抗原决定簇的抗体阳性细胞株,step3:筛选抗体,取每孔的上清液与目标抗原决定簇进行抗原抗体反应，若呈阳性，说明该孔内的杂交瘤细胞克隆为我们所需要的细胞株,.,.,单克隆和多克隆抗体的比较和用途,1、用于免疫学检测，辅助临床诊断,2、mcab用于亲和层析，分离微量

22、可溶性抗原,3、标记的mcab用于基础研究，了解细胞分化等,4、制备生物导弹用于肿瘤、移植、自身免疫疾病等的临床治疗。,.,（三）基因工程抗体(genetic engineering antibody),概念： 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括 人源化抗体如嵌合抗体、改形抗体等，单链抗体、双价抗体和双特异性抗体。,.,(1) 嵌合抗体(chimeric antibody)：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了

23、鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,1、人源化抗体,人-鼠嵌合抗体,知识拓展,.,（2）改形抗体(reshaped antibody)：将小鼠的cdr序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为cdr移植抗体。,人-鼠改形抗体,知识拓展,.,（3）完全人源化抗体： 将小鼠 ig 基因敲除，转染人 ig 基因，在小鼠体内产生人 ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体。,知识拓展,.,用基因工程方法，将抗体一条重链和一条轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片断。 特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半

24、衰期短，免疫原性低。 应用：单链抗体与重组毒素、细胞因子或药物等融合表达，用于肿瘤的导向治疗; 肿瘤定位诊断等,2、单链抗体(single chain antibody),知识拓展,.,是一类具有双功能的抗体杂交分于，两价抗体中的 fab段具有不同特异性，能与不同的表位结合。,3、双特异性抗体 (bispecific antibody),双特性抗体杀伤肿瘤细胞示意图,知识拓展,抗肿瘤和抗免疫活性细胞cdl6或cd3的双特异性抗体，不仅具有激活nk细胞或t细胞作用，而且可以通过抗肿瘤的fab段特异性结合肿瘤细胞发挥作用，提高局部nk细胞或t细胞浓度，增强效应分子杀伤肿瘤能力,.,.,多克隆抗体与

25、单克隆抗体的比较,.,思考题： 1、抗体与免疫球蛋白及球蛋白有何不同。 2、从免疫球蛋白的基本结构、酶解片段及功能区说说抗体的基本结构。 3、免疫球蛋白有哪几大类别，各自的主要特性及功能有哪些？ 4、什么是免疫球蛋白的类别转换？ 5、理解抗体多样性的原理。 6、抗体有哪些功能？ 7、什么是单克隆抗体？其制备原理和过程如何？,.,2、补体结合部位位于igg类抗体的（ ） a vh区 b vl区 c ch2区 d ch3区,3、补体结合部位位于igm类抗体的（ ） a vh区 b vl区 c ch2区 d ch3区,4、关于铰链区的组成，下列哪项是正确的（ ） a 含大量丙氨酸 b 含大量酪氨酸 c含大量脯氨酸 d 含大量苯丙氨酸,习题 1、抗体与抗原结合的部位有（ ） a 重链和轻链的v区 b 重链和轻链的cdr区 c f(ab)2片段 d fab片段,6、胃蛋白酶水解igg的