分子克隆实验流程

1、 分子克隆实验流程一、引物的稀释1、引物干粉冻存于-20，用前12000rpm离心1min；2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2L ddH2O至100M；3、稀释至10M（5L引物F+5L引物R+40L ddH2O）二、目的基因的扩增实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。扩增体系： Reagent25L50L10xbuffer (含Mg2+)2.5L5LdNTP (10mM)0.5L1LrT aq酶0.25L0.5Lprimer (10M)1.25L2.5LTempl

2、ate DNA2L4LddH2O18.5L37L反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整）95 预变性3min（95 变性30 s，60 退火30s，72 延伸45s）x3572后延伸 7min4保持电泳：120V，加2Lloading buffer，上样5L，1000bp marker 5L小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE三、目的产物切胶回收（试剂盒）四、连接实验前准备：SolutionI在冰上融化连接体系： Reagent10L胶回收DNA(50ng/L)4LPDM-18T载体1LS

3、olution I5L反应条件：16，4h（PCR仪，热盖105）/ 4过夜五、转化实验前准备：开启42水浴锅实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒）1、把感受态细胞TOP10从-80冰箱拿出并放置于冰上解冻；2、每管分装30 - 50L感受态细胞（冰浴）；3、向感受态细胞中加入5L连接产物，冰浴30min。4、42热激90S（时间不能太长，也不能太短）后静置于冰浴3min，加入750L无抗生素的LB液体培养基，37 200rpm恒温震荡培养1h。 5、4000 rpm离心2min，弃上清同时保留50L混匀菌体沉淀后均匀涂布于抗性平板上。6、37恒温培养过夜。（16小时以

4、上）LB（amp）抗性平板的制备配方：胰蛋白胨3g5g酵母提取物1.5g2.5g氯化钠3g5g琼脂4.5g7.5gddH2O300mL500mL121高压灭菌20min，降温加入氨苄（amp）抗生素（amp：LB=1:1000）六、摇菌实验前准备：生物安全柜紫外照射30min实验步骤：1、取出过夜培养的LB固体培养基平皿，观察是否有菌落长出。2、取3ml LB液体培养基于15ml管中，已经加入抗生素（氨苄），氨苄：LB培养基=1:1000（即：3L amp+3ml LB）。3、在15ml管上做好标记，分别加入从LB培养基上挑取的单个菌落，37 250rpm恒温震荡培养过夜（8小时以上 ）。七、

5、菌液PCR（目的基因引物+载体引物）实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。反应体系： Reagent20L10xbuffer (含Mg2+)2LdNTP (10mM)0.25Lprimer (10M)0.5LTemplate DNA2LrTaq酶0.25LddH2O15L反应程序：95预变性 3min，（95变性30s，60退火45s，72延伸45s）运行35个循环72 后延伸7min，4保持九、测序PCR实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、（BD+5xbuffer）Mix提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。反应体系： Reagent10L（BD+5xbuffer）Mix2.1L模板DNA（纯化产物）3.5Lprimer