毕设论文-10101044-晏洋翻译2-晏洋-10101044

1、 一种改进的兔耳窗大功率高分辨率研究再生和预成型组织摘要如果光学显微镜的全分辨率和结构分辨能力的利用达到了极限，运用耳窗技 术对毛细血管流动、细胞结构、细胞功能的微观显微镜检查研究就需要对窗 子进行特殊力学和光学设计。 为了满足这些要求，一种基于在盖玻片和载玻片之间的组织分割原则的新型 耳窗被设计了出来。 金属部分使用的是能和组织高度相容的钛，并且使用透明平行的普通盖玻片 和载玻片。 在显微镜检查时，窗子的固定尤其需要特别注意。 暴露的组织有很长的寿命因此可以允许长时间研究。 由 Sandison 在 1924 年发明介绍的耳窗技术被证明特别适合长时间观察毛细 血管床一些成分的功能，比如内皮细

2、胞和毛细血管周围的巨噬细胞，同时也被发 现适合检查组织移植。 现在基于耳窗技术的研究数量很庞大，这就证明对于显微镜检查来说， 耳窗是最流行的窗子方式。并且耳朵的毛细血管床包括了显微镜检查范围内 最著名的机体毛细血管部分。 在 1928 年 Sandison 的第一篇论文中，他阐明了三种类型耳窗的设计原则： 两个专门的窗子，一个为再生组织设计，一个为预成型组织设计；一个双用途的 的窗子包含了预成型和再生组织。他觉得这三种类型的窗子不仅通用且效率高。 但是这一类型的窗子安装比较困难因此没有得到大范围的适用。 随后Clark (1954),、Williams(1954)、Curri 和Tischen

3、dorf (1953,1954)在论文中描述了一系列不同的设计修改和它们的一些应用。 尽管在过去几年里，很多工作者修改了 Sandison 的三种原始类型的耳窗，但事实上这些修改都是基于 Sandison 的设计原则，也就是这里描述的典型。 当我们开始运用窗子技术来研究兔耳毛细血管，观察研究它们主要结构的功 能，也就是内皮细胞层，也就是内皮细胞和毛细血管周围的颗粒细胞。但很快光 学显微镜分辨率适用到了极限的问题出现了。在之前的耳窗类型（云母，有机玻 璃）中构成窗子的透明材料要么缺乏必要的光学均匀性要么太软容易产生划痕。 在我们看来，这些类型都不适合做大功率的研究，所以从很多方面上来说都需要 一

4、个新的方法来设计耳窗。 设计原则考虑到我们的观察是在装有聚光镜补充和标准目标的普通光学显微镜的辅 助下进行的。不同于一些次要的细节，修改光学显微镜是不切实际的。因为光学 显微镜的光学系统已经计算好了，所以耳窗的设计和指导原则必须是一致的，那 就是封闭的组织要尽可能的近似某种组织切片。换句话说，耳窗必须让生成的组 织层和普通的组织切片有厚度相同的顺序，并且要能把这种新生组织放在标准厚 度的载玻片和盖玻片之间。 这样的组织薄层只能在形式上包含再生组织。但由于也需要耳窗能够在预成 型组织的毛细血管床功能的研究上适用，比如观察血管活性药物的活动。因此窗 子也应该和后来的组织类型相适应。 兔子耳朵上的血

5、管化软骨膜组织被证明很适合我们的研究目的。小心解剖开 裁剪至适合厚度，200左右，同时保持血液循环。去除上面和下面的组织，并 用圆形盖玻片和相似的载玻片代替取出的组织，再分别用金属固定器固定住。暴 露的血管化结缔组织层可以用做显微镜检查（图 1）。对大功率研究至关重要的 薄层是通过对准备好的材料中心冲压而制备的。血管化组织层的圆形部分半径是 1mm，用厚为 0.18mm 的圆形盖玻片代替。然后在盖玻片下再生组织从结缔组织 病变的边缘开始生长。 图 1 兔耳窗的部分示意图，显示了耳窗的安装原则。图 2 耳室的尺寸图，侧视图。 图 3耳窗组成部分：（A）底板和螺栓，载玻片和中央玻璃板;（B）顶板（

6、C ）有盖玻片的环;（D）距离 套筒（E）螺母;（F）树脂玻璃盖。耳窗由于载玻片和盖玻片需要平行放置，所以耳窗要很精确地安装好。耳窗主要 包括三个部件：（i）放置载玻片的基板（ii）螺丝固定的顶板（iii）在螺纹环内 安装的盖玻片。再加上一套间隔套筒、螺丝、盖住盖玻片的树脂玻璃就可以完成 组装。图 2-图 5 显示了窗子的结构和尺寸。所有金属零件都是由钛金属制作的。 这种耳窗以及其它我们尝试过的窗子类型中，钛对组织的刺激是非常微不足 道的。另外，钛很容易被加工。 安装安装在兔子耳朵上的兔耳窗是由英国医学研究委员会放射科的 Mill Hill 提 供。这些兔子的耳朵不仅足够大且拥有合适的组织，同

7、时在大部分情况下都非常 的温顺。这就成为了进行大功率观察研究的一大优势。 我们根据Lofstrom 改进 Ayre 的 T 切片技术用乙醚麻醉插管后安装耳窗。尽 管在局部麻醉情况下安装耳窗是可行的，也是普遍使用的方法。但在随后的过程 中这种方法影响了局部循环，从而削弱了这种类型窗子内组织层的生物活性。 在模版的帮助下选出适合安装的耳朵部分。主要目标是找出软骨膜外的血管 化部分。这部分远离大静脉并且离耳沿足够远，这样就能在不拉伸耳朵的情况下 在显微镜载片台上固定好窗子。在耳朵组织上打三个孔，用螺栓固定窗子（图 6）。 在耳朵内部软骨膜下方切出一条和窗子半径长短相同的纵向切口。切口是在一个 稍微比

8、窗子基板大一点的区域内用牙科探针切除的与软骨分离的开放性切口。在 基板上选择一块和圆行载玻片大小相似的软骨同时使耳朵外的软骨膜保持完整。 然后放置好窗子的基板。现在耳朵外表皮和一些皮下组织被切除，圆形切除部分 的大小与窗子盖玻片大小一样。切完后必须留下 200厚的软骨膜以及更深的血 管化皮下组织层。在膜层中心，最后切割一个直径为 1mm 且与粘在载玻片基板上 的小圆玻璃相适应的圆形部分。 在螺栓上滑动三个距离套筒后，根据基板组装好顶板，并用钉子固定好。盖 玻片环根据要求拧得尽可能远一点。同时也需要非常小心，确保所制备的组织没 有过度地被压缩。 在不拉伸组织的情况下，缝合好耳朵内的纵行切口。于是

9、手术进行前需要准 备棉花、羊毛、浸渍黄素和石蜡，最后还要包扎得比较宽松。 在显微手术器械的帮助下制备好血管组织层。同时因为即使是微小的也 会导致压力增加从而闭塞的血管中的预制层，所以在所有血管被切断前用一个特 殊的名叫 microdiathermy 的设备（BrHnemarkandJonsson,1962）来凝聚它 们。 图 4根据上面描述安装好的耳窗 图 5 安装耳室的辅助设备：（A）拧盖玻片环的活动扳手; （B）用于给三个基板螺栓打孔的打孔器;（C） 用来把螺母固定在螺栓上的螺母起子（D）有机玻璃模板。 图 6 耳室的安装：（A）耳朵外为基板螺栓打三个孔（B ）暴露耳内软骨同时为载玻片切除

10、一块圆形软骨;（三）放置好基板缝合好皮肤，（D ）放置好耳朵外的基板同时皮肤显微切开时远离与耳窗盖玻片相对应的 圆形区域（E ）把顶板和盖玻片环拧到合适的位置。 观察时窗子的固定如何在显微镜的光路下更好的放置窗子涉及到包括垂直和水平面的准确定 位和观察时兔子固定这两个问题。 在我们的研究中，我们使用了一台 Leitz 公司的显微镜设备和一台改进 的Berek 聚光镜(BrHnemark,1962)，还有一个具有让聚光镜光束通过的中心孔以及从窗子底板伸出放置螺栓头的三个凹面的可互换的固定板的平台（图 7）。 固定板是能够自己设定的，这样就能让凹面始终和螺栓头的位置相匹配。窗子通 过两个可调弹簧爪

11、支固定在平台上，弹簧爪支位于窗子顶板上。这些连接物完全 是通过金属金属连接。这种连接在依靠光学显微镜分辨率对组织结构的检查是 至关重要的。也就是说，组织层不能被固定的方式所影响。 在耳窗的研究中动物一般四肢展开绑好，仰卧放置在固定板上。毋庸置疑的 是，虽然动物可以通过训练使自己适应这样的固定方式，但是这样的话就不可避 免地引入了应力因素。而且仰卧姿势在生理学上说很难长时间保持。为了消除这 些潜在的误差来源，我们在观察的时候使兔子以正常的姿势蹲伏在一个盒子里。 同时它整个的背面与颈背颈部都用带子绑好并支撑好头部。固定没有造成耳朵产 生任何压缩或扭曲。换句话说兔子是允许一些自由活动，只要它的活动不

12、对耳窗 的位置产生干扰。详细细节在图 8 中。图 7显示耳室贴到其特殊的显微镜载物台上的详情。图 8兔子在一个适合耳窗显微镜检查的盒子里。 耳窗的愈合在大多数病例中，耳窗的愈合无没有产生并发症，并且预成型组织的生命力 是很好的。和其他类型耳窗描述的一样，组织再生发生在总体空间的中央薄层上。 预制层血管床在很大程度上保留了它原有的结构。随着组织适应了新的环境和封 闭的表面，软骨膜结缔组织层也逐渐变得更加透明。 在大多数情况下，耳窗内有着毛细血管床的组织生存时间至少是一年以上， 因此为短时间及长时间的观察提供了可能性。图 9 的显微照片来自于一个一年半 大小的耳窗组织。 兔耳的皮下和皮肤组织和金属钛之间的亲密接触并没有产生不期望的反应。 这证实了以往类似钛的装置在兔子、狗和人的皮肤和粘膜的经验。 图 9 （A）和（B）表示在五秒的时间间隔内兔耳窗的同一毛细管表明红细胞不同程度的变形，以及毛细血管腔和血管内皮细胞细胞核的变化。（C）的各种类型的红细胞，血小板，内皮细胞和周边内皮细胞在兔 耳窗的小静脉内。讨论这种类型耳窗的设计最初是用来为研究循环条件和血管活性药物在预制组 织的小动脉、小静脉和毛细血管水平上的评价