利用基因工程技术表达蛋白质.ppt

1、第四章 利用基因工程技术表达蛋白质,本章的重点内容： 1. 什么是基因工程？ 2. 获得目的基因的方法有哪些？ 3. DNA双脱氧测序技术的基本原理。 4. PCR技术的基本原理及其应用。 5. 基因定点突变技术及其应用。 6. 表达载体的构建策略与技术方法。 7. 如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？,第一节 基因工程原理简介,一、基因工程的定义 本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表

2、达，借此研究目的基因的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。 广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。,目的基因获得,表达载体构建,基因的导入,整合与表达的鉴定,二、基因工程的基本步骤,表达产物的提取、纯化与鉴定,第二节 基因工程中的方法学,一、基因工程的基本技术 （一）无菌操作技术 （二）核酸的提取纯化 1. RNA提取纯化技术； 2. DNA提取纯化技术； 3. plasmid提取纯化技术。 （三）核酸电泳技术 1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS-PAGE （四）感受态细胞的制备与转化,真核细胞总RNA的电泳结果：,核酸电泳技术 1. 琼脂糖

3、凝胶电泳 2. SDS-PAGE,二、一些重要技术原理介绍 重点介绍DNA双脱氧测序技术，核酸探针技术，PCR技术等。 （一）DNA双脱氧测序,(二)核酸杂交技术（probe） 1）原理； 2）标记物； 3）种类； 4）应用,1. Dot blot,2. Southern blot： DNA,3. Northern blot: RNA,Western blot: Protein,（三）PCR技术 1.基本原理 2.引物设计 1)长度; 2)GC%; 3)stem-loop; 4)dimer; 5)错配; 6)5末端可以不配对 3.应用: 科学研究；医学与兽医临床。,Kary B. Mullis

4、 La Jolla, CA, USA. B.1944,DNA生物合成与PCR方法合成DNA的异同点: 1.相同点：均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为dNTP； 半保留复制；均为5 3方向复制。 2.不同点： 1）反应条件不同：体内为生理条件，体外为94、52及72 等变温条件； 2）参与反应的物质种类和数量不同； 3）引物不同，体内为RNA，体外为DNA，且在DNA合成后，前者 被切除掉，后者作为终产物的一部分； 4）体内为半不连续合成，体外为连续合成； 5）体内单复制原点或多复制原点，单方向或双方向复制； 6）体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行； 7）体内具有校正、修复的功能（错

5、配率较低），体外无（错配 率较高）； 8）体内DNA的复制为全部染色体DNA的复制，体外仅复制两引物 之间的DNA序列。,（四）目的基因的改造技术 1. 引物介导的基因定点突变技术 2. 盒式突变(cassette mutagenesis) 3. Genes Shuffling,三、基因工程中的工具 （一）载体 1.质粒(plasmid) 2.粘粒(cosmid) 3.噬菌体( phage) （二）工具酶 1.限制性内切酶 2.外切酶 3.连接酶 4.聚合酶: klenow I 5.核酸酶 （三）宿主菌 DH5, JM101, JM109; DE3等,四、获得目的基因的方法 基因文库（基因组文

6、库和cDNA文库），化学合 成，PCR 等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技 术。 （一）基因组文库 目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组 基因或调控序列的克隆等。,家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆 和序列分析,亚克 隆,Southern Blot,测序,序列分析,技术路线:,结果1:,GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTG

7、AGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGG

8、CCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGG

9、GCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC,卵黄蛋白基因部分DNA片段特异性探针序列,特异性探针制备,制备了大小为768bp的地高辛标记的DNA片段特异性探针，工作浓度为1:2000。,结果2:,阳性克隆的筛选和纯化,1# positive clone （about 2000 plaques/plate） Fig.3 Screening result of 1st round in situ hybridiza

10、tion 图3 第一次噬菌斑原位杂交筛选结果,YP1,2# positive clone （about 200 plaques/plate） Fig.4 Screening result of 2nd round in situ hybridization 图4 第二次噬菌斑原位杂交筛选结果,Numbers：11 positive clone （11 plaques/plate） Fig.5 Screening result of 3rd round in situ hybridization 图5 第3次噬菌斑原位杂交筛选结果,获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆,2.0,2.3,4.4,6.

11、6,9.4,23,1.4,1.6,2.0,3.5,4.3,5.0,21,1 2 3 4 5 6,kb,kb,Fig.6 Digestion analysis of recombinant -DNA of positive plaque 图6 阳性克隆-DNA的酶切分析,结果3:,mdYP基因组基因的克隆,1:Lambda DNA/Hind Marker 2: Xho, 3: Xho/Hind , 4: Hind , 5: Sal 6:DNA/EcoR+Hind Marker,1: Xho I，2: Hind 3: Xho/Hind Fig.7 Southern blot of recombin

12、ant -DNA of positive plaque with mdYP1 DNA probe DIG-labeled 图7 阳性克隆-DNA的 Southern blot,1 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100 101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT

13、200 201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA 300 301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400 401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTG

14、CGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT 500 501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600 601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700 701 TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATT

15、CGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA 800 801 ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG 900 901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA 1000 1001 ACGCCATTACATTTGTC

16、TTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 1100 1101 CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT 1200 1201 TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTG

17、CCAAA 1300 1301 ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTTCAATTCT 1400 1401 CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT 1500 1501 TATCAGCAGTTCTCGCTGGACTCACCTGACGGTCTGATTAACTATTTTGCTGTGAAATGTTA

18、AATTTATTTGATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG 1600 1601 GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGGATGAATCCATTGGGAG 1700 1701 TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA 1800 1801 GGCCACACCATCTTTGAATGAGCTCACCT

19、TTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGTAAGTAGCCAGTC 1900 1901 AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAGACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC 2000 2001 AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG 2100,获

20、得了全长3991bp的基因组序列，包含1.7kb卵黄蛋白基因组基因及其5-调控区序列。,2101 AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG 2200 2201 CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC 2300 2301 ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAA

21、TGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG 2400 2401 AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC 2500 2501 TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC 2600 2

22、601 TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG 2700 2701 CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA 2800 2801 TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCA

23、ACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA 2900 2901 ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA 3000 3001 AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT 3100 3101 TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAA

24、GGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA 3200 3201 AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT 3300 3301 TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG 3400 3401 AAAGCAAA

25、AAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA 3500 3501 GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT 3600 3601 TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAA

26、AAAAATTCACAATT 3700 3701 TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC 3800 3801 CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC 3900 3901 TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGT

27、TTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG 3991 图3. 卵黄蛋白基因组基因全序列,（二）cDNA文库的构建,家蝇早期胚胎转基因前后的差异表达研究,（三）DD-PCR技术,5-NMAAAAAAAAAAAAAn细胞总RNA或poly(A)RNA,5-NMAAAAAAAAAAAAAn cDNA 3- NMTTTTTTTTTTTT 简并锚定引物,进行PCR,随机十聚体NNNNNNNNNN NMTTTTTTTTTTTT,持续循环,NNNNNNNNNN NMTTTTTTTTTTTT,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,样品A 样品B,作Northern探针,作cDNA文库筛选探

28、针,作亚克隆和测序样品,反转录反应,切取目的带,重新扩增,回收纯化,五、重组质粒（表达载体）的构建与鉴定 1. DNA（载体和目的片段）的酶切与回收。 2. 目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下 比例：粘端：35:1；钝端：68:1 3. 转化与重组质粒的筛选、鉴定。 1）初步鉴定：抗性；-互补；快速鉴定；原位杂交；PCR。 2）酶切鉴定：大小和方向。 3）测序鉴定：双脱氧测序法。,六、基因导入技术 （一）细菌 1.氯化钙； 2.电穿孔技术。 （二）细胞 1.脂质体； 2.磷酸钙； 3.电穿孔； 4.显微注射； 5.Virus Vector。 （三）受精卵 1.显微注射； 2.电穿孔技

29、术； 3.精子载体； 4.ESC； 5.Virus Vector（ RT-V or Lentivirus-V）。,七、常用表达系统 （一）原核表达系统：包涵体；分泌型。 已成功的基因工程产品绝大部分是利用原核系统生产的，如IFN、IL、TNF、G-CSF、GM-CSF等。 （二）真核表达系统：传代细胞；酵母；生物反应器等。 1. 传代细胞：如CHO、BHK、Vero、MDCK等； 2. 酵母：毕赤（甲醇）酵母。 3. 生物反应器：如乳腺、血液、尿液、鸡蛋、昆虫等。 世界上第一个动物（山羊）乳腺生物反应器产品重组人抗凝血酶（商品名ATryn）于2006年获准上市。由全球最著名的动物乳腺生物反应器

30、研发企业美国Genzyme转基因公司研制成功。,NATURE Biotechnology, October,2000,表1. 部分已表达的蛋白质,蛋白/肽 公司 开发现状 治疗疾病,国外公司已开发的部分转基因动物产品 Development status of a selected list of proteins produced by transgenic animals,ABX-IL8 mAb Abgenix 临床 I/II 牛皮癣 ABX-EGF mAb Abgenix Preclinical EGF-依赖性癌症 a-1-抗胰蛋白酶 PPL Therapeutics Phase II

31、胆囊纤维化 a-1蛋白酶抑制剂 Genzyme Transgenics R&D 遗传缺陷 - IFN Genzyme Transgenics R&D 多发性硬化 胶原 II Pharming Preclinical 风湿性关节炎 因子 VII PPL Therapeutics Preclinical 出血时 因子 XI PPL Therapeutics Preclinical B型血友病 纤维蛋白原 PPL Therapeutics Preclinical 外伤和手术时作组织胶粘剂 胰高血素样肽-1 PPL Therapeutics R&D II-型糖尿病 人 GH Genzyme Trans

32、genics R&D 身体生长发育，脂肪动员 HAS Genzyme Transgenics R&D 血浆膨胀剂和药物赋形剂 MSP-1 (疟疾苗) Genzyme Transgenics R&D 疟疾 蛋白 C PPL Therapeutics Preclinical 防止深部静脉的血栓形成 降钙素 (salmon) PLL Therapeutics Preclinical 骨质疏松 tPA Genzyme Transgenics R&D 心肌梗塞和非栓塞,（三）提高真核表达效率的技术方法,1. 选用强启动子，如CMV、EF1等； 2. 组成型表达（可诱导表达）； 3. 增强子，如MAR序列

33、； 4. poly(A)； 5. Dhfr加压筛选系统； 6. 串联表达； 7. 稳定表达（瞬时表达）； 8. Kozak序列。,基因组序列的选择性扩增染色体扩增,以dhfr基因的扩增为例，说明基因组序列的选择性扩增机制。,二氢喋啶 FH2 FH4 CoF衍生物 合成嘌呤或嘧啶 注： （1）合成酶；（2）还原酶。,（1）,（2）,染色体扩增的本质是细胞内特定基因拷贝数的专一性大量扩增(amplification)。 （Amplification refers to the production of additional copies of a chromosomal sequence, fo

34、und as intrachromosomal or extrachromosomal DNA. ）,叶 酸,四氢叶酸,Mammalian genes for DHFR(dihydrofolate reductase) have the same relative organization of rather short exons and very long introns, but vary extensively in the lengths of corresponding introns.,1. 类型： Unstable lines and Stable lines,In unstable lines, the amplified genes are at least partially lost when the selective pressure is released, because the amplified genes exist as an extra-c