液相色谱-user

1、岛津液相色谱培训班-基础知识岛津国际贸易（上海）有限公司分析中心1Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited第一部分色谱基础知识2Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited色谱起源石油醚色谱色素混合物分离组分 碳酸钙颗粒3Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited色谱定义 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术 流动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相，色谱柱 色谱是一种分

2、离技术.mV色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离500400和定量ParabenMethylParabenEthylParabenButylParaben300Propyl20010000.00.51.01.52.02.53.0min4Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited色谱分类 高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 气相色谱Gas Chromatography (GC) 薄层色谱Thin-Layer Chromatography (TLC) 毛细管电泳Ca

3、pillary Electrophoresis(CE)5Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited色谱优点 同时分析 分离性能好 灵敏度高 (ppm-ppb) 进样量小 (1-100uL)6Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. LimitedHPLC vs GC 液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法) 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析) 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法) 适用于沸点较低、热稳定性好

4、的中小分子化合物的分析) 流动相只起运载样品分子的能力7Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. LimitedHPLC分类 正相模式 (NP-LC) 反相模式 (RP-LC) 反相离子对色谱 (IPC) 离子交换色谱 (IEC) 尺寸排阻 (GPC / GFC)8Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited反相模式 (RP) C18 (ODS) C8 (octyl) C4 (butyl)非非极极性性 苯基-Si-C18H37 TMS 氰基Si9Shimadzu Internatio

5、nal Trading (Shanghai) Co. Limited相互作用力是什么?疏疏水水性性OHC18 (ODS)弱Si强OH10Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited疏水性 如果样品有 CH3CH2CH2- : 碳链 作作用用力力强强: 芳香基 如果样品有 -COOH: 羧基作用力弱 -NH2: 氨基作用力弱 -OH: 羟基11Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited反相模式下流动相的选择优化水相（缓冲液）和有机相的比例非常重要甲醇，乙腈和 THF 是常

6、用的有机溶剂 在有缓冲液的情况下, 缓冲液的浓度和pH值非常重要12Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited溶剂极性变化对分离的影响2020 % HH22OO3030 % HH22OO40%40% / HH22OO1 : 对羟基苯甲酸甲酯2 : 对羟基苯甲酸乙酯3 : 对羟基苯甲酸丙酯4 : 对羟基苯甲酸丁酯有机相: MeOH13Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited固定相极性变化对分离的影响C18 (ODS)Si强样品SiSiC8 一般样品C4 弱样品14Sh

7、imadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited固定相极性变化对分离的影响ODSODSC8C8TMSTMS 分析条件 柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 : MeOH : H2O = 7 :3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 40 C 进样体积 : 10 uL 检测器 : UV-254 nm 峰1. 苯甲酸甲脂2. 苯甲酸乙脂3. n-苯甲酸丙酯4. n-苯甲酸丁酯15Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited离子对色谱离子对试剂 阴离子化合物 氢氧化

8、四丁基铵(TBA) 溴化四丁基铵 阳离子化合物 丁烷基磺酸钠 (C4) 戊烷基磺酸钠 (C5) 己烷基磺酸钠 (C6) 庚烷基磺酸钠 (C7) 辛烷基磺酸钠 (C8) 癸烷基磺酸钠 (C10) 十二烷基磺酸钠 (SDS)16Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited离子对色谱影响因素 离子对试剂的类型 离子对试剂的浓度 流动相的 pH17Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited 硅胶柱 氰基柱 氨基柱 二醇基柱Si硅胶正相色谱: 常用: 常用: 分析糖: 分析蛋白质

9、-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)Si化学键合相18Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited相互作用力是什么?强强HO氢键SiOHSiOH非非常常弱弱弱弱OH19Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited氢键力 如果样品有 -COOH: 羧基 -NH2: 氨基 -OH: 羟基氢键力强. 如果样品没有任何官能团，象碳水化合物 如果样品有大的基团, 由于空间障碍氢键力弱.20Shimad

10、zu International Trading (Shanghai) Co. Limited正相模式下流动相的选择 主要试剂 烷烃 (戊烷, 己烷, 庚烷, 辛烷) 芳香烃 (苯, 甲苯, 二甲苯) 亚甲基氯化物 氯仿 四氯化碳 辅助溶剂 甲基-t-丁基醚 (MTBE), 二乙醚, 四氢呋喃 (THF), 二氧杂环乙烷, 嘧啶, 乙酸乙酯, 乙腈, 丙酮, 异丙醇, 乙醇, 甲醇为了调整保留时间，可以选择一种主要试剂然后再加入辅助试剂。没有紫外吸收的溶剂更容易被检测出来。21Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited增加溶剂极性

11、0 % MeOHMeOH2 % MeOHMeOH5% / MeOH0 %2 %5% / MeOH1 :邻苯二甲酸二辛酯2 :邻苯二甲酸二丁酯3 :邻苯二甲酸二乙酯4 :邻苯二甲酸二甲酯主要试剂 : 己烷22Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited反相色谱与正相色谱的对比 反相色谱流动相极性大于固定相极性能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物 正相色谱流动相极性小于固定相极性不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC23Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. L

12、imited反相色谱与正相色谱的对比 反相 保留时间重复性好 固定相耐用 正相 对立体异构体有很好的分离 (Vitamin E等) 保留时间重复性稍差24Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited离子交换色谱R 离子吸引力+RN样品R+ + + + +SO3-样品+ + + + +25Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited离子交换色谱应用 生物领域(蛋白质, 农药, 氨基酸分析) 离子分析 阳离子交换剂(R-SO3-) 强阳离子交换剂(SCX) 弱阳离子交换剂(W

13、CX)(R-COO-) 阴离子交换剂(R N+) 强阴离子交换剂(SAX) 弱阴离子交换剂(WAX)4(DEAE)26Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited第二部分柱子基本性能参数27Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited表征色谱柱的参数硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸 填料床的长度和内径颗粒形状 球型或不规则型粒径平均颗粒直径,通常3-10m表面积颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示孔径颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300碳百

14、分率与基体物质相连的键合相的量封尾用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来28Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited如何消除拖尾 流动相中加入辅助剂三乙胺高氯酸钠 (NaClO4)在流动相中加入胺修饰剂和高氯酸钠有助于减少拖尾 ，因为这些添加物可以对硅羟基产生屏蔽效应.29Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited表征色谱柱性能的参数 容量因子 理论塔板数 理论塔板高度 分离度 拖尾因子30Shimadzu International Trading (Shanghai

15、) Co. Limited容量因子, kk =t1 - t0t0t1t0t1 = 组分峰的保留时间t0 = 死时间 (非保留时间)31Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited理论塔板数, NRtArea中国/日本药典 :N = 5.54 x ( Rt / W 1/2 )2H美国药典 :W1/2N = 16 x ( Rt / W )2H1/2W32Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited理论塔板高度, HH=L/NL：色谱柱长N：理论塔板数33Shimadzu In

16、ternational Trading (Shanghai) Co. Limited分离度, Resolution相邻两峰完全分离其分离度 Rs1.5.34Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited完全分离时的分离度Rs = 1.0Rs = 1.5峰峰形形不不是是三三角角形形 ，而而是是高高斯斯分分布布35Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited拖尾因子，T T=W0.05/2d36Shimadzu International Trading (Shanghai)

17、Co. Limited第三部分 HPLC硬件基础知识 日常注意点37Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited液相色谱简易流程图色谱柱检测器进样器柱温箱输液泵溶剂数据处理38Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited流动相的选择 采用 “HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配39Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited水的等级

18、水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水吸吸去离子水光光率率纯化水波长 (nm)因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物40Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited水的等级HPLC用水可以通过以下几个方法得到： 专门的纯水机或超纯水机:理想的HPLC用水应为18.2M的超纯水，并通过0.22m的滤膜，除去热源、有机物、无机离子等。 去离子水重蒸； 二次或三次重蒸水；不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水。41Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limi

19、ted水的等级 未注入样品时空白梯度的色谱图水中不纯物的出峰水中的不纯物保留在柱中，随之被乙腈洗脱.42Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited有机溶剂的等级 有机溶剂的等级 HPLC级 优级纯微微量量分分析析、梯梯度度洗洗脱脱 分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒)优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质43Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited有机溶剂的等级分析纯级和 H

20、PLC 级溶剂的吸光度比较图甲醇乙腈正己烷44Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited缓冲盐选择缓冲液的步骤1 .确定最佳分离状态时的流动相pH2 .选择具有与流动相pH相近的pKa 的缓冲液（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）3 .确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液）45Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited缓冲盐常用代表性的弱酸的pKa值pK1pK2pK3醋酸4.87柠檬酸3.134.766.40磷

21、酸2.167.2112.3246Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited缓冲液缓冲液的使用使用前必须过滤使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:用含5%甲醇的水溶液冲洗30min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min用纯水冲洗泵头清洗管路易受到细菌和霉菌的影响不能直接用有机溶剂冲洗缓冲盐溶液47Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited溶剂的黏度 乙腈和甲醇 黏度Water/methanolWater/methanolPressure (MPa)Wate

22、r/acetonitrileWater/acetonitrile-乙腈黏度低在相同流速时有较低的柱压-当和水混合时黏度有变化柱压也相应有变化Water (100%)Water/Organic solvent 1:1Organic solvent (100%)48Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited溶剂前处理-过滤过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙6

23、6滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂49Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited溶剂前处理-脱气脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动50Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited溶剂前处理-脱气氧 200的饱和容量100(uL)050100乙

24、醇体积 (%)氧气在1ml水-乙醇混合溶剂中的溶解度51Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited常用脱气方法 超声脱气 减压脱气 在线脱气52Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited岛津液相输液泵目的单元流速范围特性和应用LC-20AT0.001-10ml/min非凡的耐用性，适于常LC-10ATvp 0.001-9.999ml/min量分析分析LC-20AD0.0001-10ml/min无脉动，适于半微量LCLC-10ADvp 0.001-9.999ml/min

25、和 LC-MS分析LC-20AB0.0001-10ml/min无脉动，适于半微量LC和 LC-MS分析53Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited柱塞泵的基本结构LC-10ATvpLC-10ADvpLC-20ATLC-20AD串联式柱塞往复泵并联式微体积柱塞往复泵单向阀单向阀单向阀54Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. LimitedLCLC-20AT20ATLC-20AT55Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Lim

26、itedLCLC-20AD20AD56Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. LimitedLCLC-20AB20AB57Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. LimitedLC-20AD/20AT/20AB的概要Low pressure GE unitPump heads (in series)Drain valveInstalled insidePressure sensorDumperCheck valvesLC-20ATLC-20ATDrain valvePump heads (i

27、n parallel)Pump heads (in parallel)Pump heads (in parallel)Pressure sensorfor Pump Bfor Pump BDumperDrain valvePressure sensorDumperCheck valves for Pump BCheck valves for Pump ACheck valvesLC-20ABLC-20ADLC-20ABLC-20ADSpecificationsLC-20AD （228-45000-XX）LC-20AT （228-45001-XX）LC-20AB （228-45002-XX）Pu

28、mp typeParallel double plungersSerial double plungersParallel double plungers (two pump)Stroke volume10 LFront : 47 L, rear : 23 L10 LMaximum operating pressure40 MPaProgrammable flow rate0.0001 mL/min to 10.0000 mL/min0.001 mL/min to 10.000 mL/min0.0001 mL/min to 10.0000 mL/min1 % or 0.5 L/min, whi

29、chever2 % or 2 L/min, whichever is1 % or 0.5 L/min, whicheverFlow accuracyis larger (0.01 mL/min 2.00largeris larger (0.01 mL/min 2.00mL/min)(0.01 mL/min 5 mL/min)mL/min)Flow precision0.3 % (0.1 % RSD) or less58Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited柱塞往复泵结构示意图马达和凸轮泵头单向阀柱塞杆柱塞杆密封圈腔体59Shi

30、madzu International Trading (Shanghai) Co. Limited单向阀工作原理单向阀结构单向阀工作原理吸液冲程出口单向阀排液冲程 宝石球抛光面泵头球座进口单向阀60Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited等度洗脱输液泵进样器柱温箱检测器色谱柱单单一一或或混混合合溶溶剂剂61Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited梯度洗脱A色谱柱检测器进样器A 泵柱温箱B 浓度BB泵时间62Shimadzu International Tradi

31、ng (Shanghai) Co. Limited高压/低压梯度系统梯度洗脱装置： 高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入 低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。低压梯度比例阀梯度混合器常压高压常压高压HPGELPGE63Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited使用梯度洗脱的原因当等度洗脱时：MeOH / H2O = 6 / 4分分析析时时间间长长分分离离度度差差MeOH / H2O = 8 / 2( column : ODS )64Shimadzu International

32、 Trading (Shanghai) Co. Limited使用梯度洗脱的原因当采用梯度洗脱时：95%甲醇浓度30%在最短时间内获得最佳的分离65Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited梯度洗脱方式梯梯度度洗洗脱脱形形式式：线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系折线梯度：66Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited梯度洗脱形式的选择67Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited梯度洗脱要点梯梯度度洗洗脱脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注注意意事事项项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器