紫色马铃薯查尔酮合成酶基因(CHS)的克隆及分析

1、紫色马铃薯查尔酮合成酶基因(CHS)的克隆及分析胡朝阳，周友凤，龚一富，金 思，王何瑜，赵群芬（宁波大学海洋学院/教育部应用海洋生物重点实验室，浙江宁波 315211）摘要：【目的】从紫色马铃薯中克隆 CHS 的 cDNA 全长序列，并分析其组织表达水平以及诱导剂处理后基因的表达与花青素含量积累之间的关系。【方法】采用 RT-PCR 和 RACE 方法克隆紫色马铃薯 CHS 的 cDNA 全长序列，通过在线软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析，半定量 RT-PCR 检测 StCHS 在紫色马铃薯组织中的表达特异性以及蔗糖和赤霉素处理后 StCHS 的表达。采用分光光度计法测定紫色马铃薯花青素含量

2、。【结果】克隆获得紫色马铃薯 CHS 的 cDNA 全长 1 490 bp，包含 1 170 bp 的 ORF，该基因编码 389 个氨基酸。推测 StCHS 蛋白含有 Cys164、Phe215、 His303 和 Asn336 4 个活性位点，构成 CHS 蛋白的催化中心。StCHS 的表达具有组织特异性，在茎、叶柄和叶中表达较强，在根、块茎和叶轴中几乎检测不到 CHS 的表达。赤霉素能促进 CHS 的表达从而促进花青素的积累；蔗糖能够显著促进紫色马铃薯花青素的积累，但对 CHS 的表达影响不明显。【结论】从紫色马铃薯中克隆获得 CHS 的 cDNA 全长序列，该基因表达具有组织特异性，S

3、tCHS 是紫色马铃薯花青素合成途径中的一个限速酶基因。关键词：紫色马铃薯；查耳酮合成酶基因；花青素；赤霉素；蔗糖；基因表达Cloning and Expression Analysis of a Chalcone Synthase (CHS)Gene from Purple Potato (Solanum tuberosum)HU Chao-yang, ZHOU You-feng, GONG Yi-fu, JIN Si, WANG He-yu, ZHAO Qun-fen(Faculty of Marine Science, Ningbo University/Key Laboratory o

4、f Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo 315211, Zhejiang)Abstract: 【Objective】 The aim of this study was to clone the full length cDNA of chalcone synthase from purple potato, to analyze its expression at different organs and the relationship between CHS expression and anthocya

5、nin accumulation after treated with different concentrations of GA3 and sucrose. 【Method】 The full-length cDNA of CHS was isolated from Solanum tuberosum by RT-PCR and RACE. Semi-quantitative RT-PCR was used to analyze the expression levels of StCHS in different organs, and the expression levels ind

6、uced by GA3 and sucrose were adopted by semi-quantitative RT-PCR. The anthocyanin content of purple potato was measured by spectrophotometer method. 【Result】 The cloned full-length CHS was 1 490 bp in length, containing a 1 170 bp open reading frame (ORF), which encodes 389 amino acids. The deduced

7、amino acids contained Cys164, Phe215, His303, and Asn 336 active sites, which constitute the catalytic center of CHS. CHS is expressed at different levels in different organs, which was found to be expressed in stems, leaf stalks and leaves but not in roots, tubers or rachises. The anthocyanin accum

8、ulation was slightly induced by GA3 as well as the expression of CHS. The anthocyanin accumulation was strongly induced by sucrose, but the CHS expression was not notably induced. 【Conclusion】CHS gene was cloned from purple potato and its expression is tissue-specific. StCHS is a rate-limited gene i

9、n the flavonoid synthesis pathway of purple potato.Key words: purple potato (Solanum tuberosum); chalcone synthase gene (CHS); anthocyanin; GA3; sucrose; gene expression0 引言【研究意义】花青素是植物体内重要的次级代谢产物，具有许多重要的生物学功能，如抵御病原微生物入侵、促进豆科植物根瘤形成及保护植物免受紫外线伤害1-2等。由于花青素具有很高的抗氧化活性，可被人类用作营养物质3和抗癌物质4-5。查尔酮合成酶基因（chalcon

10、e synthase，EC 4；CHS）是紫色马铃薯花青素合成途径的第一个关键酶基因，与紫色马铃薯花青素的形成关系密切，了解其结构特征、表达调控方式及与花青素在块茎中合成和积累的关系，有助于弄清紫色马铃薯花青素积累的分子机理。【前人研究进展】查尔酮合成酶催化丙二酰辅酶 A（malony CoA）与对羟基苯丙烯酰辅酶 A（coumaryc CoA）缩合成四羟基查尔酮（naringenine chalcone）6。目前，许多 CHS 已从双子叶植物、单子叶植物以及裸子植物中被克隆，如温州蜜柑、百合、洋葱、高粱、野葛、拟南芥、银杏等7-12。CHS 表达量的改变可导致花色的改变，采用抑

11、制 CHS 的表达量来改变矮牵牛花色的研究比较深入。Courtney- Gutterson 等13将菊花正义 CHS 和反义 CHS 导入开粉红色花的菊花中，分别获得了开浅红色和白色花的转基因植株，说明 CHS 是影响花青素积累的一个关键酶基因。CHS 的表达能被不同的外源刺激和植物发育不同阶段的内源性因子以及组织特异性所调控。Pang 等14用UV-B 和伤害分别处理银杏叶片1 h 和48 h，其CHS 表达显著增强；De Len等 15 研究表明软腐病菌和灰霉菌能诱导小立碗藓 CHS 的表达，从而增强其抵抗病菌的能力。程龙军等16研究表明赤霉素、蔗糖和光照等信号分子可通过诱导花青素生物合成

12、中的一些基因的表达来提高花青素的含量。Weiss 等17研究表明，GA3 可诱导矮牵牛 CHS的表达来影响花青素的积累。【本研究切入点】目前，植物花青素生物合成的基因表达、信号传导与调控的研究集中在花器官，但对块茎等地下部位花青素的积累鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究拟采用RT-PCR 和RACE 方法克隆获得 CHS 的cDNA 全长序列，建立半定量 RT-PCR 反应体系及花青素含量的测定方法。1 材料与方法1.1植物材料和处理紫色马铃薯试管苗由宁波大学海洋学院植物组织培养实验室保存。赤霉素和蔗糖对紫色马铃薯花青素含量和 CHS 表达的影响试验于 2009 年 4 月在宁波大学海洋学院

13、植物组织培养实验室进行。赤霉素和蔗糖对紫色马铃薯 CHS 表达影响试验：将根长 1 cm 左右、茎长 8 cm 左右的试管苗从 MS 培养基中取出，洗净培养基，把根浸没于蒸馏水中培养3 d，再分别用不同浓度的赤霉素和蔗糖处理，12 h 后提取 RNA 做半定量 RT-PCR。赤霉素和蔗糖对紫色马铃薯花青素含量影响试验：试管苗在添加不同浓度赤霉素或蔗糖的 MS 培养基中培养，30 d 后测其花青素含量。赤霉素浓度分别为 0、0.5、1.0、2.0 和 4.0 mgL-1，蔗糖浓度分别为 0、30、60、90 和 120 gL-1。CHS 组织特异性表达研究：试管苗先在花盆中栽培 30 d，然后提

14、取根、茎、叶、叶柄、叶轴和块茎 6 个组织的 RNA，做半定量 RT-PCR。1. 2 CHS 的全长 cDNA 克隆采用 Trizol 试剂（Invitrogen，USA）提取 RNA。取 5 L 总 RNA 用 oligo(dT)17 为引物按照说明书（SMARTTM，Clontech，USA）进行反转录。RNaseH处理后，单链的 cDNA 混合物作为扩增核心序列的模板。用 FCHS（5-TCTTCGTTCACGTAGTACTAAAC -3）和 RCHS（5-TTTATTAGGTATTTGATTACAT AG-3）为引物扩增 StCHS 核心序列。根据扩增得到的核心序列，设计扩增 5UT

15、R 和 3UTR 的引物：CHS5-1（5-TGCCTCTTTGCCAAGTTTAG-3）和CHS5-2（5-GTGCCTTACGATACTCCTCC-3）以及CHS3-1（5-CAATATGTCAAGTGCCTGTGTG-3）和CHS3-2（5-AGTGTTGCTACTTAGTGGGTTGG-3）。按照美国 Clontech 公司的 RACE 试剂盒进行 5RACE和 3RACE。PCR 扩增测序后用 Vector NTI Suite 8.0软件拼接出 CHS 全长。1. 3 生物信息学分析StCHS 的开放阅读框（ORF）、一级结构以及序列比对（BLAST）都在 NCBI 网站（http:

16、/www.ncbi. ）进行，StCHS 蛋白的分子量与等电点预测应用Computer pI/MW Tool 软件（）。StCHS 的二级结构在 SOPMA 服务器（/tools/）上完成18。蛋白质三维模型的同源建模使用 网站提供的相关生物信息学分析软件进行。CHS 系统进化树用生物信息学软件 Clustal W（1.82）和 MEGA version 4.1。1. 4 半定量 RT-PCR 分析设计 1 对特异性引物 fchs（5-CATGGAGGA

17、GT ATCGTAAGGCAC-3）和 rchs（5-TCACTGGGTCCACGGAATGT-3）进行半定量 PCR。选用 actin 为内参，2.1 StCHS 的克隆与序列分析引物序列为 actinF（5-CGTCGCTATTCAGGCAGTCPCR 扩增得到 1 025 bp 的核心序列，通过 RACE-3）和 actinR（5-CAGCTTCCATTCCCACAAG-3）。得到500 bp 的3端序列和167 bp 的5端序列。用Vector按日本 TaKaRa 公司的一步法 RT-PCR 试剂盒说明书NTI Suite 8.0 软件将 3端序列、5端序列和核心序列拼进行 PCR，扩

18、增循环数为 28 个循环。接得到 1 490 bp 的 StCHS 全长。把基因全长序列输入1.5 花青素含量测定NCBI 网站的 ORF Finder 程序，结果显示，StCHS 包含花青素含量测定参照 Dedaldechamp 等19的方法，1 170 bp ORF、184 bp 3UTR 和 136 bp 5UTR（图 1）。并稍加修改。取 0.1 g 试管苗，磨碎后加入 10 mL 酸BLAST 显示，克隆得到的紫色马铃薯 CHS 的性乙醇（添加 0.1% HCl），28孵育 18 h。然后 10 000cDNA 序列与野生马铃薯（AY954033.1）、西红柿r/min 离心 10

19、min，取上清，测出 530 nm 和 657 nm 处（AK327204.1）、烟草（FJ969392.1）和杂交矮牵牛吸光值，花青素含量可以表示为：Q=A530-0.25A657（AF233638.1）的同源性分别为 96%、95%、89%和（mgg-1FW-1）。88%。2 结果2.2 StCHS 蛋白质分析StCHS 编码一个由 389 个氨基酸组成的蛋白质，粗体下划线表示起始密码子，粗体斜体下划线表示终止密码子，阴影表示 poly(A)尾The start codon (ATG) was underlined in bold and the stop codon (TGA) was

20、italically underlined in bold. The poly (A) tail was painted with shadow图 1紫色马铃薯查尔酮合成酶基因（CHS）全长 cDNA 序列及预测的氨基酸序列Fig. 1The full-length cDNA sequence and the deduced amino acid sequence of Solanum tuberosum chalcone synthase分子量大小为 42.46 kD，等电点（pI）6.72。StCHS蛋白二级结构预测结果显示，有 166 个氨基酸参与形成 -螺旋（alpha helix），

21、占所有氨基酸的 42.67%，有 69 个氨基酸参与形成伸展链（extended strand），占总氨基酸的 17.74%，另有 125 个氨基酸参与形成无规卷曲（random coil），占总氨基酸的 32.13%。为更进一步了解该 CHS 蛋白的特征，通过使用SWISS-MODEL20根据紫花苜蓿 CHS 晶体进行同源建模获得了紫色马铃薯 CHS 蛋白的三维结构模型（图2）。三级结构中包括 Cys164、Phe215、His303、Asn336 4个活性位点，并且这 4 个活性位点在三级结构上是相邻的，构成 CHS 蛋白的催化中心，这与对紫花苜蓿（Medicago sativa）的 CH

22、S 晶体结构进行研究得到的其 4 个活性位点完全相同21。同时得到的 StCHS 蛋白还具有 5 个袋状桂皮酰结合位点 Ser133、Glu192、Thr194、 Thr197 和 Ser338 以及 7 个袋状环化位点 Thr132、Met137、Phe215、Ile254、Gly256、Phe265 和 Pro375。为了解StDXS 和其它植物DXS 之间的进化关系，使用 Clustal X 软件和MEGA4 软件构建了几种不同植物 CHS 蛋白的系统进化树。结果（图 3）表明，紫色1、2、3、4 分别为 StCHS 蛋白的 4 个活性位点 Cys164、Phe215、His303和 A

23、sn3361, 2, 3 and 4 represent four active sites of StCHS Cys164, Phe215, His303, and Asn336, respectively图 2 StCHS 蛋白质三维结构模型Fig. 2The 3-D model structure of StCHS马铃薯和烟草（Nicotiana tabacum）同属于茄科，在进化树中聚为一个分支，表明两者亲缘关系最接近，这与植物分类结果是一致的。图 3 用植物 CHS 氨基酸序列构建的系统进化树Fig. 3Molecular phylogenetic tree of the deduc

24、ed amino acid sequences of CHSs from plants2.3StCHS 表达和花青素积累分析通过对紫色马铃薯不同组织（根、茎、块茎、叶、叶轴和叶柄）的半定量 RT-PCR 分析发现（图 4），在茎、叶柄和叶中检测到 StCHS 的表达，且在茎和叶柄中表达较强，而在根、块茎和叶轴中几乎检测不到。表明 StCHS 表达具有组织特异性。1：块茎 Tuber；2：根 Root；3：茎 Stem；4：叶柄 Leafstalk；5：叶轴Rachise；6：叶片 Leaf图 4 紫色马铃薯 StCHS 组织表达分析Fig. 4Expression profile of StC

25、HS in different tissues of purple potato用不同浓度 GA3 处理 30 d 后，紫色马铃薯试管苗的花青素含量相对于对照组均有不同程度增加，赤霉素对紫色马铃薯花青素的积累具有促进作用（图5-A），当 GA3 浓度为 1.0 mgL-1 时，花青素含量达到最大值为 2.90 mgg-1FW-1，是对照组的 2.4 倍。但卡方分析表明，GA3 处理的不同试验组之间花青素积累没有显著差异（P0.05）。用不同浓度蔗糖处理 30 d 后，紫色马铃薯试管苗的花青素含量随着蔗糖浓度的升高而升高，趋势明显（图 5-B）。当蔗糖浓度为 120 gL-1 时，花青素含量达到

26、最大为 4.8 mgg-1FW-1，是对照组的 7.1 倍。卡方分析结果也表明，不同浓度蔗糖处理的试验组之间花青素的积累具有极显著的差异（P0.01）。为了进一步理解花青素合成的分子机理以及 StCHS 在花青素合成中作用，用半定量 RT-PCR 检测不同浓度 GA3 或者蔗糖处理 12 h 后 StCHS 表达量变化。不同浓度 GA3 处理后 StCHS 的表达量相对于对照组都有所促进，而且这种促进作用比较明显。但是 StCHS 的表达并没有随着 GA3 的浓度而梯度变化，各处理组中 StCHS 表达量比较接近。蔗糖处理组中只有当浓度为 120 gL-1 时，StCHS 的表达量才有显著的增

27、强，其它几个处理组与对照组相比并没有显著的变化。A：不同浓度赤霉素处理后 StCHS 的表达及花青素的积累；B：不同浓度蔗糖处理后 StCHS 的表达及花青素的积累A: Expression profiles of StCHS and anthocyanin accumulation of plantlets after treated with different concentration of GA3; B: Expression profiles of StCHS and anthocyanin accumulation of plantlets after treated with

28、different concentration of sucrose图 5诱导剂（GA3 和蔗糖）诱导下的 StCHS 表达和花青素积累Fig. 5Expression profiles of StCHS and anthocyanin accumulation after induced by elicitors (GA3 and sucrose)3 讨论一般都要使用试剂盒扩增，可以高效得到尽可能长的5端。其中提取得到高质量的 RNA 是试验成功的关键本研究以紫色马铃薯为材料、采用 RACE 方法克之一，好的植物 RNA 电泳后有 3 条条带，5.8S 最暗，隆得到 StCHS 全长。得到

29、5UTR 是基因克隆的难点，28S 最亮，其亮度约为 18S 的两倍。由于花青素代谢相关的基因在茎、叶表达较强，所以做 5端时用茎叶的 RNA 做 RACE 反应。克隆 3UTR 时，除了用试剂盒外，也可使用其它更为廉价的方法：其中一种方法就是用 oligo(dT)17 为引物进行反转录，然后以 oligo(dT)17 为下游引物做巢式 PCR；也可以做锚定PCR ，可以 AD-AT （5-AAGCAGTGGTATCAACG CAGAGTGTAC(T)25VN-3）（Clontech，Mountain View,CA）为引物进行反转录，然后以 AD（5-AAGCAGTGGTATCAACGCAG

30、AGT-3）为下游引物做 PCR。这 2 种方法都能有效地得到 3UTR，其中第二种方法与试剂盒中介绍的克隆 3UTR 的原理是相同的，而且克隆的效率也是相当高的。虽然也可以采用试剂盒中提到的克隆5UTR 的原理而使用普通试剂克隆基因的5UTR，但操作步骤繁琐，成功率不高，而且得到的 5UTR 往往比较短。紫色马铃薯 StCHS 的表达具有组织特异性，且该基因的表达部位与花青素的积累部位基本符合。本研究结果表明，StCHS 在茎和叶柄中表达较强，盆栽的紫色马铃薯的茎和叶柄呈现明显的紫色；该基因在叶片中也有表达，由于叶片正面有较多叶绿素而看不出紫色，但叶片的背面特别是叶脉呈现紫色；该基因在其它

31、3 个组织几乎没有表达，这些组织几乎看不出紫色。紫色马铃薯成熟时，块茎中会积累很多花青素，而本试验只检测了培养30 d 的马铃薯结出的未成熟块茎，其体积只有两颗花生米大小，切开块茎，其为白色，还没有积累花青素，所以在块茎中没有检测到 StCHS 的表达。赤霉素是一类属于双萜类化合物的植物激素，能调节植物生长发育的过程，例如种子萌发、茎的伸长、果实发育和谷类糊粉层基因表达等22。本试验中 GA3 促进了紫色马铃薯花青素含量积累，但促进作用并不显著；GA3 也促进了 StCHS 的表达，同样，不同处理组中 StCHS 的表达差异并不明显。花青素含量的变化与 StCHS 的表达基本一致，可以说明 S

32、tCHS 是紫色马铃薯花青素合成限速酶之一。赤霉素对其它植物花青素含量影响也有研究，其中有促进花青素积累的也有抑制花青素积累的。例如：赤霉素能促进矮牵牛花23-24、长春花25、玫瑰花26以及洋蒲桃27中花青素的积累，而抑制了玉米叶28以及低磷酸盐条件下生长的拟南芥花青素的积累29。赤霉素对植物花青素合成的调控机制尚未被完全理解，还有待更深入的研究。糖类不但为植物的生长发育提供能源及碳源，而且具有类似植物激素的信号传导功能。糖类作为信号传导过程的初级信使，调节植物生命周期各个阶段中的许多重要的生理过程30-32。本试验研究了蔗糖对紫色马铃薯花青素积累及 StCHS 表达的影响。蔗糖促进了紫色马

33、铃薯花青素的积累，并且促进作用极显著；蔗糖对 StCHS 表达的影响不明显，各处理组的 StCHS 表达量与对照组大致相同。蔗糖虽然不能诱导 StCHS 的表达，但能促进紫色马铃薯花青素的积累，说明蔗糖能促进紫色马铃薯花青素合成途径中其它限速酶基因的表达。糖类诱导其它植物花青素积累及花青素合成相关基因的表达也有研究。如蔗糖是诱导拟南芥幼苗花青素积累最有效的诱导剂33-34；糖类也是矮牵牛正在发育的花朵中花青素合成及花青素合成相关基因表达所必需的35。4 结论通过 PCR 和 RACE 方法，克隆得到了 StCHS 的 cDNA 全长序列。半定量 RT-PCR 分析表明，StCHS的表达具有组织

34、特异性，在茎、叶柄和叶中表达较强，而在根、块茎和叶轴中几乎检测不到StCHS 的mRNA。赤霉素能促进花青素的积累以及 StCHS 的表达，说明 StCHS 是紫色马铃薯花青素合成途径中的一个限速酶基因。蔗糖对紫色马铃薯花青素的积累具有极显著的促进作用，但对 StCHS 的表达影响不明显。References1 Wasson A P, Pellerone F I, Mathesius U. Silencing the flavonoid pathway in Medicago truncatula inhibits root nodule formation and prevents auxi

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