广东省珠海市金海岸中学高三生物一轮复习课件选修3基因工程

1、DNA重组技的基本工具,专题基因工程,什么叫基因工程？ zxxk,基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,并通过体外DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术.,（一）基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人们需要的新的生物类型和生物产品,切割, 拼接, 导入, 表达,基因重组,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,获取,抗虫基因,与运载体DNA拼接 导入,棉花细胞(含抗虫基因),棉花

2、植株(有抗虫特性),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与运载体DNA连接,关键步骤三：,抗虫基因导入受体(棉花)细胞,1. 限制性核酸内切酶“分子手术刀”,限制酶主要是从原核微生物中分离纯化出来的。能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间 的磷酸二酯键断开。 特点：特异性。 即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,（二）DNA重组技术的基本工具,大肠杆菌(EcoR)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A

3、之间切开。,限制酶,黏性末端和平末端,当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,2. DNA连接酶“分子缝合针”,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,外源基因(如抗

4、虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？,导入过程需要运输工具载体。,载体的作用有哪些？,作用一：作为运输工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。 作用二：利用载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。,作为载体必须具备哪些条件？,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。 载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去; 5) 载体DNA分子大小应适合,

5、以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作.,3.基因进入受体细胞的运载”分子运输车”,常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒,质粒：,质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子 质粒是基因工程最常用的载体。 绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。,大肠杆菌的质粒：,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。,基因工程的基本操作程序,专题基因工程,基因工程的基本操作程序主要

6、包括 四个基本步骤：,1）目的基因的获取 2）基因表达载体的构建 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测与鉴定,步骤一：目的基因的获取,目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因, 获取目的基因是实施基因工程的第一步 。,如与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健相关的基因、与毒物降解相关的基因，以及与工业所需用品相关的基因等。,从基因文库中获取目的基因：,基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因

7、文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,人工合成目的基因,如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接合成。,利用PCR技术扩增目的基因,步骤二：基因表达载体的构建,1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达

8、的过程，称为转化。,步骤三：目的基因导入受体细胞,什么叫显微注射技术？,用口径为1m的DNA注射器，将大量的目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。,3.将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: 首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞. 第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.,1.将目的基因导入植物细农杆菌转化法,2.将目的基因导入动物细胞

9、-显微注射法,1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。 2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,基因探针：,基因探针就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。,步骤四：目的基因的检测与鉴定,DNA分子杂交原理：,DNA分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。其基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用一段

10、已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。,1检测转基因生物染色体的DNA上是否插入目的基因-分子水平检测 2检测目的基因是否转录出了mRNA-分子水平检测,3检测目的基因是否翻译成蛋白质-个体生物学水平的鉴定,如一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、

11、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,基因工程的应用,专题基因工程,基因工程在农业上的应用：,1）高产、稳产和具优良品质的品种 用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。 2）抗逆性品种 将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高温等抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。如转基因抗虫棉。,二、动物基因工程前景广阔,1.用于提高动物生长速度,2.用于改善畜产品的品质,3.用转基因的动物生产药物,4.用转基因的动物作器官移植的供体,5.基因工程药品异军突起,转基因动

12、物的乳腺。,就基因药物而言，最理想的表达场所是哪里？,是指把人或哺乳动物的某种基因导入到哺乳动物(如鼠、兔、羊和猪)的受精卵里，目的基因若与受精卵染色体DNA整合，细胞分裂时，该基因随染色体的倍增而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，使性状得以表达，并稳定地遗传给后代，从而获得基因产品。这样一种新的个体，称为转基因动物。,什么叫转基因动物？,1）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。 2）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。 3）从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转基因动物又可无限繁殖。

13、,为什么乳腺能成为基因药物最理想的表达场所呢？,在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生物体的哪些结构中提取？,药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。,传统生产方法的缺点,由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。,可利用什么方法来解决上述问题？,利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。,胰岛素是治疗糖尿病的特效药。一般临床上使用的胰岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，用该方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，远不能满足社会需要。1979年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌DNA分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。1982年，美国一家基因公司用基因工程

14、方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了30%50%。,基因工程药品 胰岛素,干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。此外干扰素对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。 传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取，每300L血液只能提取出1mg干扰素。19801982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，是传统的生产量的12万倍。1987年上述干扰素大量投放市场。,基因工程药品 干扰素,治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提

15、取生长激素。 现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。,基因工程药品 生长激素,基因诊断：,也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。 探针制备：放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的DNA分子； 原理：利用DNA分子杂交原理；,三、基因治疗曙光初照,基因诊断技术在什么方面发展迅速？,在诊断遗传性疾病方面发展迅速。目前已经可以对几十种遗传病进行产前诊断。,1）珠蛋白的DNA探针 镰刀状细胞贫血症 2）苯丙氨酸羧化酶基因探针 苯丙酮尿

16、症 3）白血病患者细胞中分离出的癌基因制备的DNA探针 白血病,举例,基因治疗：,是指是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。,1、体外基因治疗 1990年9月，美国对一名患有严重复合型免疫缺陷症的4岁女童，实施了基因治疗。 2、体内基因治疗 1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒作载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因转入患者组织中。,基因工程与食品业,基因工程为人类开辟新的食物来源。 1）鸡蛋白基因在大肠杆菌和酵母菌中表达获得成功。这表明，未来能用发酵罐培养的大肠杆菌或酵母菌来生产人类所需要的卵清蛋白。 2）用基因工程的方法从微生物中获得人们所需要的糖类、脂

17、肪和维生素等产品。,基因工程为食品工业中提供了什么前景？,基因工程与环境保护,1）用于环境监测。 2）用于被污染环境的净化。,基因工程在环保方面有什么应用？,例如：用DNA探针可以检测饮用水中病毒的含量。此方法的特点是快速、灵敏，1吨水中有10个病毒也能检测出来。,通过基因工程方法怎样进行环境监测？,蛋白质工程的崛起,一、蛋白质工程崛起的缘由,二、蛋白质工程的基本原理,蛋白质工程的基本途径包括： 从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相应的脱氧核苷酸序列（基因）,（一）蛋白质的分子设计与改造 蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质的一级结构、晶体结构和溶液

18、构象的研究，积累了成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，并编制成系统的数据库，得以从中找出蛋白质分子间的进化关系、一级结构和高级结构的关系、结构与功能的关系方面的规律。,（二）蛋白质改造工程举例 1水蛭素改造 水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由65或66个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体HV2的设计方案，将47位的Asn（天冬酰胺）变成Lys（赖氨酸），使其与分子内第4或第5位Thr（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活

19、性提高4倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。,2生长激素改造 生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸侧链，如第18和第21位His（组氨酸）和第17位Glu（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药还