生物样品2010.ppt成都.ppt

1、生物样品检测技术,中国疾病预防控制中心 陶雪,概述 生物样品的采集和保存 生物样品检测方法 生物监测质量保证规范,一、概述,生物样品定义 机体的体液、分泌物、排泄物以及脏器组织等，如血液、唾液、乳液、泪液、汗液、粪便、尿液、头发、指甲等。,生物样品测定的意义,反映人体接触毒物的水平 了解毒物在体内的吸收、分布、生物转化和排除情况 为职业病的临床诊断和药物疗效提供可靠的依据 制定生物样品中有毒物质的生物接触限值提供科学依据,生物样品测定的内容,测定生物样品中有毒物质的含量 测定有毒物质的代谢产物 测定生物样品中毒物引起生化指标的改变 测定生物样品中酶学指标,生物样品的本底值,定义 生物样品的本底

2、值也称参比值，是指有些生物监测指标在不接触职业毒物的健康人群，也可检测到的一定水平。,制定生物样品本底值的意义,1.是劳动卫生检验和职业病防治、诊断研究的基本资料。 2.评价环境污染水平 3.了解职业者接触有毒物质的程度，评价工作场所的污染情况。 4.为制定卫生标准，制定生物接触限值提供科学的依据。,制定生物样品本底值的基本要求,1.确定分析方法：首选标准的或统一的分析方法。否则，应根据分析方法制定程序（程序包括测定条件、标准曲线、检测限、精密度、准确度、干扰实验、样品的稳定性）选择分析方法。 2.测定对象的选择：测定对象通常选择不接触被测毒物的正常人。（排除了影响测定指标的疾病和因素的人）,

3、制定生物样品本底值的基本要求,3.确定样本数量：样本数量的确定应根据测定的目的的要求和被测指标的波动范围及人力、物力而定，一般不少于100例。 4.确定本底值范围：按统计学方法对测定结果进行正态性检验，根据测定结果的分布类型，选用相应的统计方法。偏态分布用百分位法计算本底值范围；测定数据成正态分布，用正态分布计算本底值范围。,二、生物样品采集和保存,采样方法 采样时间和间隔 测定目的 储藏 存放,采集何种样品,采样时间的选择,具有生物限值的化合物，其生物材料采集具有明确规定，应严格执行。 没有限值的生物样品，采集时间应根据毒物代谢动力学为依据： 半减期短的(几分钟几小时)化合物，其在各种组织中

4、的水平变化很快，所以采样时间限制要严格； 半减期较长的毒物或代谢物，它们在各种组织中的浓度反映了较长时间的接触程度，所以采样时间可以不太严格。,采样时间的选择,在生物限值或检测方法中规定的采样时间： 班前是指工作班前1小时。 班中是指开始正常工作后2小时到下班前1小时。 班末是指下班前1小时。 班后是下班后1小时。 下一班班前是指第二个工作班前1小时。 工作周末的班末是指一个工作周（通常为5个工作班）的最后一个工作班下班前1小时。,采样环境,检测对象应离开工作场所，脱去工作服，洗净手、脸及取样部位，有条件的要在洗浴后进行。 采样地点应清洁，没有污染；选择避风和上风方向的场所进行，同时注意由于通

5、风造成的污染。 检测原形化合物时，对环境的污染要特别注意。,容器的选择和清洗,一般根据待测物的化学性质、样品的性状和样品需要保存的条件来选择容器。 待测物是无机金属和类金属化合物，可用高压聚乙烯塑料、聚丙烯塑料、石英、硬质玻璃等容器。 待测物为有机化合物，采样用的容器应选用玻璃或聚乙烯等制品。,容器的选择和清洗,注意事项： 要避免使用橡胶和添加染料的制品。 如果样品需要冷冻保存，则不宜用玻璃容器，以防冻裂。 采样用的容器应进行本底值抽检，空白值要低于方法的检出限。 在采样容器上必须贴上统一的标签，标签上注明采样日期、样品编号(与采样记录用统一的编号)、加入了什么防腐剂及加入量等项目。,头发的采

6、集和保存,采集头发的优点 采样时受检者无疼痛、无创伤 样品容易储藏和运送 样品可长期保存，必要时可复检能够反映某 个时期微量元素的吸收和代谢的历史。,三、生物样品的检测方法介绍,本部分仅介绍目前常用的生物样品中化学物质的检测方法,常用检测技术,分子光谱（分光光度法）,紫外分光光度法 红外分光光度法 可见分光光度法 荧光分光光度法,用于无机和有机化合物的测定,原子光谱法,原子吸收光谱法 (AAS) 原子荧光光谱法 (AFS) 原子发射光谱法 (AES),主要用于金属和类金属的测定,色谱法,用于分离和测定多种有机化合物和阴离子等化合物,电化学法,用于测定氟及一些金属化合物，灵敏度高，精密度取决于仪

7、器性能和操作。 催化极谱法 电位溶出法 离子选择电极法,样品检测定量方法,校准曲线法 标准加入法 内标法,定量方法：校准曲线法,标准曲线法：用标准溶液直接配制标准系列进行测定，样品基体不干扰测定时使用。 工作曲线法：样品基体对测定有干扰时，在标准系列中加入样品基体直接进行测定，或同样品一起处理后再测定。,校准曲线的要求,定量方法：标准加入法,样品基体对测定有干扰时，取等量的样品若干份，其中一份不加标，其它分别加入不同量的标准溶液，制成标准系列，进行样品处理后测定。各信号值减去试剂空白信号后绘制标准曲线，其延长线与浓度轴的交点为样品测定值。,定量方法：内标法,内标法是一种间接或相对的校准方法，在

8、分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除由于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。 操作 在分析试样中加入已知量的内标物，同时测定内标物和待测物的信号，以信号比对浓度比绘制标准曲线，或直接计算，从而得到待测物含量。 内标物的要求 与待测组分性质相似，如沸点、极性、化学结构等； 分析试样中不存在，且不与被测组分起化学反应； 与待测组分的出峰时间相近，且又不共溢出 ； 选择合适的内标物加入量，最好接近待测物的量。,生物监测质量保证规范职业卫生生物监测质量保证规范,中华人民共和国国家标准 GBT 161261995 Quidelines for quality

9、 assurance of biological monitoring GBT 1732006 Specifications of quality assurance for biological monitoring in occupational health,职业卫生生物监测质量保证规范,职业卫生生物监测实验室的基本要求 生物样品的采集 生物样品的运输和保存 生物样品的预处理 生物样品的测定 检测结果的报告和评价,职业卫生生物监测实验室的基本要求,人员 从事生物监测评价的人员必须熟练掌握生物监测指标、职业接触生物限值及其检测结果评价等方面的知识和技术。 从事职业卫生生物监测的质量保证人员

10、必须掌握与生物监测指标、职业接触生物限值和生物样品采集和检测有关的质量保证知识以及实验室质量保证管理技能。,职业卫生生物监测实验室的基本要求,仪器设备 实验室应具备从事生物样品采集、运输、保存和检测所需的仪器设备,其使用性能应满足要求。 实验室使用的计量仪器要依法定期检定和校准;不能使用未经检定或检定不合格的计量仪器。当仪器设备的检测性能发生变化或损坏时,必须维修或校准,并经检定合格后才能使用。,职业卫生生物监测实验室的基本要求,试剂 实验使用的水和试剂要满足检测的要求,所含杂质不能影响检测;不能使用过期、变质、受污染或无标签的试剂。,职业卫生生物监测实验室的基本要求,试剂 实验室配制标准溶液

11、时,要使用基准物质或分析纯以上的试剂,试剂的分析性能应与待测物相同或相似;使用的溶剂应与样品溶液相同或相似。应有配制记录。记录包括试剂名称、配制浓度、配制方法、配制日期、稳定期、配制人等。配制的标准溶液贮备液应.专人保管,密封低温保存;在有效期内使用。使用前,检查标准溶液贮备液的性状和体积等的变化,若有变化,应废弃。低浓度的标准应用液宜当日配制和使用。实验室应尽量使用国家认可的标准物质或标准溶液,并有档案记录,内容包括标准号、标准名称、生产单位、采购日期、有效使用日期、采购人、使用领取人、领用量、领取日期报废日期等。,职业卫生生物监测实验室的基本要求,实验室环境及其他要求 实验室应保持清洁、整

12、齐,各种仪器设备放置合理有序,有利于实验操作和保证检测质量。,职业卫生生物监测实验室的基本要求,实验室环境及其他要求 分析天平应放置在专用的防尘、防震防腐蚀、防潮和防日光直射的天平室内；有条件的实验室保持恒温恒湿。 气温、气压和湿度对检测有影响的情况下,实验室应配备气温、气压和湿度的测量设备;有条件的实验室保持恒温恒湿。 产生和使用有害有毒物质、易燃易爆物质和污水等的实验室应配备通风柜、防火和防爆等防护设备和用品以及污水排放设施。,生物样品的测定,分析方法的选定 分析方法应优先采用国家颁布的标准方法。在分析方法（标准方法，推荐方法或本实验室方法）选择前应对该方法的准确度、精密度、检测限定量下限

13、进行验证，符合实验室要求后，写出本实验室的详细的操作程序。,生物样品的测定,方法确认 准确度 测定结果与被测对象的真值接近的程度，用误差或相对误差表示.评价准确度的方法有以下三种（按优先顺序排列）:,a. 对照分析:用标准物质评价方法准确度。测定基体和浓度相同或相近的标准物质，根据测定结果与标准品的给定值的符合程度来估计分析方法的准确度； b. 比较实验:与另一分析方法，最好是标准检验方法，对同一度样进行分析，比较所得测定值，根据其符合程度来估计方法准确度； c. 加标回收百分率:在试样中加入定量被测物的标准溶液，从测定结果中减去样中被测物的含量后，计算加入量（预期值）回收的百分率。 加标的量

14、及加标待测物的化学形式应尽量与试样中被测物的含量相近。加标后的测定值不得超过方法的检测上限。当测定物含量10-8（mL）时，回收率必须在85105之间。,生物样品的测定,精密度 对试样进行反复多次测定所得数据之间的离散程度。精密度包括连续精密度（批内精密度），重现性精密度（批间精密度）和再现性精密度（实验室间的精密度）。连续精密度、重现性精密度和再现性精密度的定义见附录。 精密度的表现方法:精密度用平均值加标准差（）或变异系数（CVSX，）来表示。 在一般的生物监测方法中，如被测物的浓度10-9g/g（mL）时，变异系数（包括连续精密度和重现性精密度）10；如测定浓度小于10-9g/g（mL）

15、，变异系数应小于平行样最大允许误差,生物样品的测定,检测限 能测定出并区别于空白样的最小浓度或量。 a. 光谱法:多次测定（十次以上）空白的标准偏差的三倍所相当的浓度； b. 比色法:校准曲线上查出吸光度0.02所对应的浓度或量或多次测定（十次以上）空白的标准偏差的三倍所相当的浓度； c. 色谱法和电化学法:仪器噪声的三倍信号所对应的浓度或量。 检测限要满足实验的要求。,生物样品的测定,定量下限 在给定的置信水平区间内，能报出定量结果的最低浓度或量。 定量下限用空白多次测定的平均值的 10 倍标准偏差所相当的浓度或量来表示。,生物样品的测定,质量控制 校准曲线 a. 每次分析样品时必须绘制校准

16、曲线。校准曲线应由空白及三五个已知浓度的标准溶液，按照与样品相同的测定步骤，包括样品的前处理操作制成。如已经过充分的验证，确认省略某些操作步骤对校准曲线无显著影响时，可免除这些步骤。如校准曲线与浓度具有极好的直线关系，并且有高度的重现性，可在每次分析样品时只选择两个适当浓度的标准物和空白，同时进行测定，以核校原有校准曲线。色谱法宜用内标法制做校准曲线。,b.在绘制校准曲线时，以测量信号值为纵坐标，以浓度（或量）为横坐标， 将测定数据标在坐标纸上作图。若测量信号与浓度（或量）相关系数大于或等于0.999（原子吸收法大于0.995），可用最小二乘法原理获得的线性回归进行计算。对于线性关系不好的一系列浓度与信号值，不可采用回归的办法来绘制校准曲线，宜采用绘图法绘制校准曲线。若测量仪器的微机具有各种校准曲线的绘制程序，则可直接使用微机绘制校准曲线。,c. 利用校准曲线推测样品浓度时，样品浓度应在所作校准曲线的浓度范围以内，不得将校准曲线任意外延。 d. 如基体效应对测定有影响时则可使用含有与实际样品基体类似的工作标准系列进行校准曲线的绘制或使用标准加入法。,平行样的分析 测定频率 根据监测目的决定平行样测定的频率。监测工作目的是针对个体的，100 的样品进行平行双样分析。监测目的