肿瘤免疫与检测

Tumorimmunology,肿瘤免疫学,肿瘤免疫学(Tumorimmunology),肿瘤免疫学:是研究肿瘤及其相关分子的免疫原性、机体对肿瘤的免疫应答、机体免疫功能与肿瘤发生、发展的相互关系以及肿瘤的免疫学诊断和免疫防治的科学。近年来，人们对肿瘤相关基因、肿瘤抗原、抗瘤效应、肿瘤逃避、标志物检测、免疫治疗等进行了深入研究，从而促进了肿瘤免疫学进展。,肿瘤免疫学(Tumorimmunology),一、肿瘤相关基因二、肿瘤抗原三、抗肿瘤效应四、肿瘤逃避五、标志物检测六、免疫治疗,一、肿瘤相关基因,肿瘤相关基因,肿瘤相关基因: 细胞癌变过程中发生改变的基因种类很多，重要的有：癌基因抑癌基因肿瘤转移基因肿瘤转移相关基因肿瘤转移抑制基因,肿瘤相关基因,(一)癌基因(oncogene)：是动物细胞以及致癌病毒基因组内固有的一段功能单位。正常情况下癌基因表达受严密控制，当胞内调控机制受损时，癌基因可过度激活并异常表达，从而导致正常细胞癌变。迄今已发现百余种癌基因，根据其来源可分为： 1.病毒癌基因 virus oncogene 1968年 Duesberg 等首次发现，基因来自病毒，因而被命名为病毒癌基因。 Rous 肉瘤病毒：基因组“编码酪氨酸蛋白激酶”基因，证实它在细胞转化中起关键作用,肿瘤相关基因,2.细胞癌基因 cellular oncogene1972年Bishop 核酸分子杂交法证实： 几乎在所有高等动物细胞基因组中，都有和v- onc相似的DNA序列； 细胞癌基因在正常情况下的表达有时间、空间限制，表达产物参与细胞分化、增殖；癌基因在生物进化中具高度保守性; 正常细胞中的癌基因和肿瘤细胞中的癌基因的核苷酸顺序十分相似，后者可使NIH 3T3 细胞恶性转化，前者需经激活后才具有转化能力；说明：在正常情况下细胞癌基因不致癌，生理条件下内外环境中的某些刺激可激活癌基因，从而调节细胞的生长、分化和信息传递。,肿瘤相关基因,3.原癌基因 未激活的细胞癌基因 在人体正常细胞中存在 是一种正常基因 作用：调控细胞生长和分化, 广泛存在于生物界中，从酵母到人的细胞中都存在按原癌基因的结构、产物的功能、所在的位置分为四类： 1. 蛋白激酶类 2. 信息传递蛋白类 3. 生长因子及其受体类 4. 核内蛋白类,肿瘤相关基因,(二) 抑癌基因tumor suppressor gene：正常细胞抗癌基因或抑癌基因存在于正常细胞内，能抑制细胞转化和肿瘤发生。抑癌基因的丢失或失活与肿瘤的发生、发展密切相关。最早由A.Knudson Jr.提出，多数肿瘤都存在抑癌基因的改变，肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活都是癌化过程的一部分； 抑癌基因的主要功能 (1) 诱导终末分化；(2) 维持基因稳定； (3) 触发衰老，诱导细胞程序性死亡；(4) 调节细胞生长；(5) 抑制蛋白激酶活性；(6) 改变DNA甲基化酶活性；(7) 调节组织蛋白酶活性 ；(8) 调节血管形成 ；(9) 促进细胞间联系等,肿瘤相关基因,(三) 肿瘤细胞转移基因与转移抑制基因： 肿瘤细胞转移基因的激活和/或转移抑制基因失活均可诱发肿瘤细胞转移表型而导致转移的发生，此类基因本身并不引起正常细胞癌变，而是参与其调控作用。,目前发现,癌基因 有100多个：ras基因家族参与多种肿瘤的形成与发展，82年以来，在膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、及造血系肿统瘤中，均检出了ras癌基因的异常；myc基因参与细胞凋亡，c-myc基因与多种肿瘤发生发展有关。抗癌基因 有7个：nm23基因是肿瘤转移抑制基因。p16是比p53更重要的一种新型抗癌基因等转移基因（metastasis gene）有一些?直接促进转移发生的关键基因，其存在或表达增强会引起侵袭转移的发生转移相关基因（ metastasis-asscciated gene）有一些?只涉及转移的某个阶段，并非参与整个转移过程。,二、肿瘤抗原(tumorantigen),二、肿瘤抗原(tumorantigen),1.概念：是指细胞在癌变过程中出现的新抗原物质的总称，作为肿瘤免疫诊断和免疫治疗的靶分子。,二、肿瘤抗原(tumorantigen),2.肿瘤抗原研究主要历程：在20世纪最初，寻找和证实肿瘤抗原，研究没有取得明显进展20世纪50年代，纯种小鼠的培育成功，证实了肿瘤抗原的存在20世纪60年代，证明淋巴细胞、巨噬细胞和抗体等均具有抗肿瘤效应。20世纪70年代，单抗问世推动了肿瘤免疫诊断技术和肿瘤免疫治疗的发展。20世纪80年代，肿瘤抗原的性质、MHC分子在肿瘤中作用、T杀伤机制等有更深了解。20世纪90年代，多种人类肿瘤抗原基因克隆成功，肿瘤标志物检测，推动了肿瘤免疫学发展。,3、化学物质诱发的肿瘤抗原,病毒诱发的肿瘤抗原,二、肿瘤抗原(tumorantigen),4.肿瘤抗原产生的分子机制：细胞癌变过程中合成了新的蛋白质分子；由于突变等使正常蛋白质分子的结构发生改变；正常情况下处于隐蔽状态的抗原表位暴露出来；多种膜蛋白分子的异常聚集；胚胎抗原或分化抗原的异常表达；异常的细胞蛋白的特殊降解产物；目前人们已在自发性和实验性的动物和人类肿瘤细胞表面发现了多种肿瘤抗原。,二、肿瘤抗原(tumorantigen),5.肿瘤抗原的分类1).肿瘤抗原特异性分类 肿瘤相关抗原（TAA） 肿瘤特异性抗原（ TSA ） 90年代初比利时的Thierry Boon研究组巧妙地应用T细胞克隆技术，找到了人类肿瘤特异性抗原，黑色素瘤细胞与淋巴细胞重复进行淋巴细胞肿瘤细胞混合培养发现瘤细胞MAGE基因家族，MAGE-1-4、6、12基因与肿瘤相关。这些基因在其他多种组织来源的肿瘤也有高表达，这些基因编码的抗原有称为肿瘤特异性抗原。,二、肿瘤抗原(tumorantigen),2).肿瘤诱发和发生情况的分类法理化因素诱生的肿瘤抗原 特异性强,免疫原性弱,个体特异性；病毒诱生的肿瘤抗原 病毒特异性，无组织和种属特异性，免疫原性强；自发性肿瘤 各自独特的抗原性，很少或几乎完全没有交叉反应，免疫原性弱，无明确诱因；胚胎抗原 分泌型和膜型，免疫原性弱，易形成耐受；,（5）正常自身成分的异常表达 组织特异性抗原：来源于特定组织的肿瘤可表达该组织的分化抗原：恶性肿瘤细胞表达其他正常组织细胞特异的分化抗原恶性肿瘤细胞表达未分化细胞的分化抗原 癌胚抗原： AFP、CEA、胚胎性硫糖蛋白抗原（FSA)、2H铁蛋白、胎盘碱性磷酸酶以及神经外胚层衍生的癌胚抗原等。,3）按抗原的基因类型分为：静止基因（silent gene）的表达产物：癌变细胞则将该基因启动表达，被T细胞识别产生排斥反应。分化抗原基因的表达产物： CEA是胚胎时期表达的产物，出生后该基因关闭。细胞癌变后则重新开启该基因，成为免疫系统识别的靶子。MART-1、tyrosinase、gp100等均为分化抗原。癌基因的异常高表达：HER-2/neu某些正常细胞有微量表达，但自身T细胞对其耐受，癌变细胞由于异常高表达打破了这种耐受，成为免疫系统可识别的靶子。突变的抑癌基因产物：如突变的p53可造成其产物的堆积，同样可作为免疫系统识别的靶子。,突变的癌基因表达产物：正常的ras基因产物无免疫源性，癌细胞中在编码ras第12或61 位发生基因突变，形成具有新表位的p21ras产物，而被免疫系统识别。染色体易位产生的融合基因产物：白血病细胞的原癌基因c-abl 从9号染色体易位到22号染色体与bcr基因连接形成bcr-abl融合基因编码210KD融合蛋白被T细胞识别。致癌病毒性基因产物：HPV的16和18型与宫颈癌密切相关，HPV16的E6、E7基因能使宫颈鳞状上皮转化为肿瘤细胞。而E6、E7的基因产物可被T细胞识别。其他: 如MUC-I基因编码的与细胞膜相关的粘蛋白，在某些癌细胞中高表达，关键是糖基化不完全，而暴露出多肽骨架，成为免疫识别的靶子。,肿瘤抗原的呈递同样存在（内源性抗原呈递和外源性抗原呈递）两种形式： 肿瘤细胞本身由MHC I类分子将内原肿瘤抗原小肽呈递给CD8+ T细胞；肿瘤抗原基因所编码的多肽一般含有多个抗原表位，由MHC I类分子结合并能诱导CTL的小肽是其中极小部分。人工合成肿瘤抗原小肽用于肿瘤的免疫治疗。目前已鉴定出一批与人MHC I类分子结合的肿瘤抗原小肽。 专职APC也可捕捉肿瘤释放出的抗原，由MHC II类分子呈递给CD4+ T细胞。,6、肿瘤细胞的抗原呈递,三、抗肿瘤效应,三、机体抗肿瘤的免疫效应机制,1.T细胞介导的抗肿瘤作用1).CD4+Th1：2).CD8+CTL：,三、机体抗肿瘤的免疫效应机制,2.NK细胞介导的抗肿瘤效应 穿孔素 Fas/FasL ADCC 细胞因子,3.巨噬细胞介导的抗肿瘤效应溶酶体酶：活化的巨噬细胞与肿瘤细胞结合后，通过溶酶体酶等直接杀伤肿瘤细胞，且杀伤作用强弱与溶酶体进入肿瘤细胞数量有关；提呈抗原：处理和提呈肿瘤抗原，并通过分泌IL-1、IL-12等激活T细胞，以产生特异性抗肿瘤细胞免疫应答； ADCC：巨噬细胞表面上有FcR，通过特异性抗体介导ADCC效应杀伤肿瘤细胞；分泌细胞因子：活化的巨噬细胞分泌TNF、一氧化氮(NO)等细胞毒性因子间接杀伤肿瘤细胞。,三、机体抗肿瘤的免疫效应机制,4.树突状细胞：DC是近几年研究的热点。 诱导T细胞抗肿瘤免疫它是最强的APC。 近期研究证实DC可分泌的exosomes（外泌小体）或称为dexosomes的小体具有抗原呈递密切相关的MHC I、II类分子和共刺激分子。 IL-10、IL-12、IFN-g可促进DC分泌exosomes。 动物实验表明：肿瘤抗原多肽致敏的骨髓DC制备的exosomes可在体内诱导高水平肿瘤特异性CTL，治愈荷瘤小鼠，它有望成为一种新型的肿瘤疫苗。5、其它细胞,三、机体抗肿瘤的免疫效应机制,6.机体抗肿瘤的体液免疫学机制1)ADCC 防止动物肿瘤细胞的血流播散与转移具有重要意义。2)补体依赖的细胞毒作用 激活补体系统溶解肿瘤细胞，在防止癌细胞转移中具有一定作用。3)干扰瘤细胞的黏附作用 抗体与肿瘤细胞膜抗原结合-肿瘤细胞粘附丧失-控制肿瘤生长和转移。4)形成免疫复合物 抗体+抗原=浓集抗原提呈抗原T。5)调理作用,三、机体抗肿瘤的免疫效应机制,四、肿瘤逃避机体免疫攻击的机制,1.肿瘤细胞缺乏激发机体免疫应答所必需的成分,1）肿瘤抗原的免疫原性弱及抗原调变（抗原表位减少或缺失）2）MHC抗原表达异常 3）肿瘤细胞表面“抗原覆盖”或被封闭 （ 封闭抗体可溶性肿瘤抗原肿瘤抗原抗体复合物封闭因子）4）肿瘤抗原的加工、提呈发生障碍 不能将自身MHCI抗原转至表面5）协同刺激分子及黏附分子表达下降,2.肿瘤细胞的逃逸3.肿瘤抗原诱发免疫耐受4.肿瘤细胞诱导免疫细胞凋亡肿瘤细胞高表达FasL活化T表达FasT凋亡5.免疫抑制作用 分泌TGF-、IL-10抑制抗瘤效应,五、肿瘤标志物概述及检测,肿瘤标志物,肿瘤标志物：指体内肿瘤存在并反映其一定的生物学特性的生化物质。从临床应用角度出发，是指在肿瘤发生和增殖的过程中，由肿瘤细胞合成、释放，或者是宿主对肿瘤反应性产生的一类物质，这类物质在血液、体液及组织中可以定量或定性检测到，以此作为辨认和追踪肿瘤存在和发展的标志。,(一) 肿瘤标志物作用,专家们对肿瘤标志物的作用归纳为7点:1.在筛选项目中的应用（早期诊断）2.出现肿瘤症状或可疑肿物后的鉴别诊断3.生物特点和疾病的阶段的判定4.手术，化疗和放疗的监测 5.肿瘤标志物在监控中的作用 6.确定不知来源的转移肿瘤的原发肿瘤 7.许多肿瘤标志物的(同时)联合应用,(二)肿瘤标志物的分类,1)肿瘤细胞分泌的标志物 (1)分化抗原标志物(淋巴瘤标志物等)； (2)胚胎抗原标志物(CEA，AFP等)： (3)糖脂或精蛋白类(CA-199,-125，CA-153，CA-50等) (4)同功酶类标志物(NSE，PAP，IRE，PLAP等) (5)激素类标志物(HCG， ACTH， CT等) (6)肿瘤相关抗原(PSA，SCC，CYFRA-211) (7)基因类标志物(P53基因，癌基因等) (8)其它；多胺(PUT)、唾液酸(SA)等2)宿主反应标志物 血清铁蛋白、2微球蛋白、白细胞介素2受体、肿瘤坏死因子(TNF)、新喋呤等。3)不进入循环体液的标志物：,1.分化抗原标志物检测,主要是膜性的分子,少部分为分泌性分子,甲胎蛋白化学本质：68-71KD单一肽链分泌(或表达)：细胞正常卵黄囊、胎肝合成主要临床意义：原发性肝癌诊断或检测100-350 有可能是肝细胞癌350-500有可能是肝细胞癌500-100 可能是肝细胞癌1000 肝细胞癌 反映胎儿状况常用检测方法： CLIA(chemiluminescent immunoassay) RIA(radiommunoassay) EIA(enzyme iommunoassay) GIA(colloid gold iommunoassay),2.胚胎抗原标志物,2.胚胎抗原标志物,癌胚抗原CEA化学本质：150-2000KD糖蛋白分泌(或表达)：胎肝、肠等的一种组织抗原主要临床意义： 内胚层分化来的肿瘤：尤其消化道腺体肿瘤，结肠癌70-90%、大肠癌65-75%、胃癌45%。 判断恶性肿瘤预后常用检测方法：CLIA RIA EIA GIA,糖类抗原CA-50化学本质：唾液酸酯和唾液酸糖蛋白为主要成分分泌(或表达)：正常组织不产生，细胞恶变产生，消化道肿瘤高表达，上皮类肿瘤患者体液中出现主要临床意义：恶性肿瘤诊断和预后检测常用检测方法：IRMA(iommunoradiometric assay) EIA,3.糖蛋白类抗原（carbohydrate antigen,CA）,糖类抗原CA-199化学本质：500KD粘蛋白型糖蛋白分泌(或表达)：正常胰胆体液极微量，消化道肿瘤高表达，特异性敏感性高于CA-50主要临床意义：消化道肿瘤筛选、检测、诊断：胰腺癌诊断、预后判断的较好指标。常用检测方法：CLIA IRMA EIA,3.糖蛋白类抗原（carbohydrate antigen,CA）,糖类抗原CA-125化学本质：200-1000KD糖蛋白分泌(或表达)：正常人心包膜间皮细胞、输卵管、子宫内膜微量表达，卵巢癌高表达，脱落入血代谢快，测得结果反映肿瘤近期变化状况。主要临床意义：妇科恶性肿瘤诊断、预后、转归判断：卵巢癌最可靠的早期诊断标志（特异性80-100%、敏感性92%）常用检测方法：CLIA IRMA EIA,3.糖蛋白类抗原（carbohydrate antigen,CA）,糖类抗原CA-153化学本质：糖蛋白分泌(或表达)：正常人血清中浓度极低，乳腺、卵巢癌高表达，主要是乳腺癌标志主要临床意义：乳腺癌诊断、预后、转归判断常用检测方法：CLIA IRMA EIA,3.糖蛋白类抗原（carbohydrate antigen,CA）,4.同功酶类标志物,神经特异性烯醇化酶NSE化学本质：三个亚基组成烯醇化酶，NSE为型分泌(或表达)：NSE存在神经组织主要临床意义：小细胞肺癌诊断、疗效、复发判断：最特异、敏感的指标神经内分泌肿瘤的诊断和治疗检测常用检测方法：RIA,4.同功酶类标志物,前列腺酸性磷酸酶PAP化学本质： 100KD糖蛋白分泌(或表达)：前列腺上皮细胞合成、肝肾血小板等多种组织存在，主要存在精囊，血中含量极低。主要临床意义：前列腺癌筛选、诊断、疗效检测检常用检测方法：IRMA,5.激素类标志物,HCG化学本质：（16KD）(23KD)两个亚基组成糖蛋白分泌(或表达)：人滋养层细胞产生。主要临床意义：滋养层细胞监护、早孕诊断指标常用检测方法：CLIA RIA EIA GIA,6.肿瘤相关抗原,前列腺特异抗原PSA化学本质： 32KD糖蛋白分泌(或表达)：前列腺上皮细胞合成，血中低水平存在。主要临床意义：前列腺癌诊断、预后判断指标，美国50岁以上男性普查指标。常用检测方法：CLIA RIA EIA,7.基因类标志物,癌基因：90多种，ras、myc等家族抗癌基因：对癌基因表达调控，P53（53KD蛋白质）调整基因常用检测方法：表达的蛋白质分子免疫组化技术基因分子生物学方法8.其它：多胺(PUT)、唾液酸(SA)等,9. 宿主反应标志物,IL-2R 肿瘤、免疫性疾病TNF 肿瘤、败血症、创伤、免疫性疾病常用检测方法： ELISA,10.不进入循环体液的标志,人乳脂肪球蛋白（HMFG）：肺癌、胃肠道癌、前列腺癌等 常用检测方法：免疫组化、放射免疫分析,（四）肿瘤标志物应用前景,继续寻求新的灵敏和特异指标联合检测数种指标：结肠癌：CEA、CA19、CA125、AAG等，胰腺癌：PCAA、CA199、CA50、CA125、PaA等肺癌：CEA、SA、NSE、CK-BB、TPA、CA199、CA126等乳腺癌：、CEA、CA125、CAM26、CA199等卵巢癌：CA125、CA199、TPA、LAP、CEA等,六、免疫治疗,肿瘤免疫治疗(Immunotherapy of Tumors ): 最近十几年来倍受关注的研究领域, 其基本思路是通过体内或者半体外方法来调动宿主免疫系统的抗肿瘤免疫应答能力, 消灭已经形成的肿瘤细胞或者抑制其进一步发展。肿瘤免疫治疗的关键是克服宿主对肿瘤细胞的免疫忽视状态。,Tumor immunotherapy with antibodies:将具有细胞毒作用的毒素、放射性物质或细胞毒性药物与肿瘤特异性抗体偶联之后可用于肿瘤的治疗。从理论上看，这种负载了不同毒素的抗体分子能够像“定向导弹”一样直接而特异地杀伤肿瘤细胞。,1、肿瘤的抗体免疫治疗,Cellular immunotherapy of tumors:从肿瘤患者外周血或肿瘤组织块中分离所需要的肿瘤特异性淋巴细胞,在体外将其迅速扩增之后回输给肿瘤患者进行治疗。 常用免疫细胞包括T细胞、NK细胞和树突细胞等。,2.肿瘤的细胞免疫治疗,Experimental tumor vaccines:用编码肿瘤抗原的基因作为DNA 疫苗或者制备重组病毒瘤苗(tumor vaccine)，或者用人工合成的肿瘤抗原肽配以佐剂免疫动物均可得到有效的抗肿瘤保护效应。另外,用DC与肿瘤细胞融合之后,或者用肿瘤抗原装载纯化的 DC,再回输给患者的临床观察也