专血脂及血浆脂蛋白检验新

第十章 脂代谢紊乱检验,1,教学目标和要求,1、掌握脂蛋白的分类及其主要功能；高脂血症的分型及血液生化特点；血脂、脂蛋白和载脂蛋白测定的原理和方法。,2、熟悉各种脂蛋白的组成与结构要点；异常脂蛋白血症的原因；血脂检查前应注意的问题。,3、了解载脂蛋白的种类与生理功能；各个检验项目的临床意义和应用。,2,动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS),冠心病急性事件（不稳定型心绞痛、急性心肌梗死和冠脉猝死）,血脂、血浆脂蛋白及载脂蛋白检验的重要性,3,一、血脂及血浆脂蛋白,血脂：是血浆中的中性脂肪（甘油三酯和胆固醇）和类脂（磷脂、糖脂、固醇、类固醇）的总称,定义：,脂蛋白：脂类难溶于水，正常血浆脂类物质与蛋白质结合成脂蛋白的形式存在。,第一节 概述,4,（一）血浆脂蛋白的分类,超速离心法：根据脂蛋白在一定密度的介质中漂浮速率不同而进行分离的方法。,电泳法：根据不同密度的脂蛋白所含蛋白质的表面电荷不同，利用电泳将其分离，并与血浆蛋白质的迁移率比较以判断其部位。,分离方法,5,超速离心法：,乳糜微粒（chylomicron,CM）,极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,VLDL）,中间密度脂蛋白（intermediate density lipoprotein,IDL）,低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）,高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL,脂蛋白（a）lipoprotein (a),Lp(a),乳糜微粒、前-、和 四条脂蛋白区带,电泳法,6,7,（二）血浆脂蛋白的组成与结构,组成：,蛋白质、甘油三酯、磷脂（phospholipid，PL）、游离胆固醇（free cholesterol ，FC）及胆固醇酯（cholesterol ester，CE）等成分组成。,8,结构：,大致为球形颗粒，由两大部分组成，即疏水性的内核和亲水性的外壳（图10-1）。内核由不同量的CE与TG组成，表层由载脂蛋白、PL及FC组成，FC及PL的极性基团向外露在血浆中，载脂蛋白是兼性化合物，它的疏水部分掩蔽在脂蛋白中，而亲水部分突出于脂蛋白颗粒的表面。,9,（三）载脂蛋白,脂蛋白的蛋白部分称为载脂蛋白(apolipoprotein，Apo),定义：,种类：,按1972年Alaupovic建议的命名方法，用英文字母顺序编码，分为ApoA、B、C、D、E、F、G、H、J等。由于氨基酸组成的差异，每一型又可分若干亚型。,10,功能：,与脂质的亲和作用而使脂质溶于水性介质中。运转胆固醇和甘油三酯。作为脂蛋白外壳的结构成分，与脂蛋白外生物信息相联系。以配体的形式作为脂蛋白与特异受体的连接物。激活某些与血浆脂蛋白代谢有关的酶类,分布及特点：自学了解,11,（四）脂蛋白受体,定义：,脂蛋白受体是一类位于细胞膜上的糖蛋白。它能以高度的亲和方式与相应的脂蛋白配体作用，从而介导细胞对脂蛋白的摄取与代谢，进一步调节细胞外脂蛋白的水平。,12,脂蛋白与脂蛋白受体的作用：,不仅是运送脂蛋白至细胞所必需，也是从血和外周组织中有效清除具有潜在致动脉粥样硬化的脂蛋白所必需的。,种类：,已有很多种，主要有LDL受体、残粒受体（remnant receptor）及清道夫受体（scavenger receptor）。,13,LDL受体： 不仅能识别ApoB100，也可识别ApoE，在细胞结合、摄取和降解LDL及其它含ApoB100的脂蛋白过程中起中介作用，对维持细胞和全身胆固醇平衡起重要作用。,各种脂蛋白受体功能,残粒受体： 能识别ApoE，是清除血液循环中CM残粒和-VLDL残粒的主要受体，它也能结合含ApoE的HDL。,清道夫受体： 主要存在于巨噬细胞表面,介导修饰LDL(包括氧化LDL和-VLDL)从血液循环中清除。,14,（五）脂质转运蛋白,定义：,血浆中脂蛋白部分含有一种特殊的转运蛋白，能促进血浆各脂蛋白间胆固醇酯、甘油三酯和磷脂的单向或双向转运和交换，这类特殊转运蛋白称脂质转运蛋白（lipid transfer protein,LTP）。,组成：,胆固醇酯转运蛋白（cholesterol ester transfer protein,CETP）,磷脂转运蛋白（phospholipid transfer protein,PTP）,甘油三酯转运蛋白（triglyceride transfer protein,TTP）,15,(六)血浆脂蛋白代谢,分类：,1. 外源性代谢途径：指食物中摄入的胆固醇和甘油三酯在小肠中合成CM及CM代谢的过程 。,2. 内源性代谢途径：指肝脏合成VLDL，然后转变为IDL和LDL，并被肝脏或其它器官代谢的过程,3. 胆固醇的逆向转运：,HDL参与将胆固醇从外周组织运输到肝脏的过程。,16,17,18,19,二、脂蛋白代谢紊乱及其与动脉粥样硬化的关系,（一）高脂蛋白血症,定义：,高脂血症（hyperlipidemia）是指血浆中胆固醇或/ 和甘油三酯水平升高。血浆脂类以血浆脂蛋白形式存在，因此，高脂血症一定是高脂蛋白血症（hyperlipoproteinemia）。,近年来，已逐渐认识到血浆中HDL降低也是一种脂代谢紊乱。,20,21,22,分类：,1按临床表型分类,主要是基于各种血浆脂蛋白升高的程度不同而进行分型。该分类法不包括病因学，故称表型分类。,（1）型高脂蛋白血症：又称家族性高乳糜微粒血症,（2）a型高脂白血症,（3）b型高脂蛋白血症：,（4）型高脂蛋白血症,（5）型高脂蛋白血症,（6）型高脂蛋白血症,23,24,2按是否继发于全身性疾病分类,继发性高脂血症：,原发性：,继发性者由一些全身性疾病引起血脂异常，如糖尿病、甲状腺功能减退症、肾病综合征、肾功能衰竭、肝胆疾病、系统性红斑狼疮、肥胖症、饮酒等。此外，某些药物如-受体阻断剂、降压药等也可引起血脂异常。,在排除继发性高脂血症后，可诊断为原发性。已知部分原发性高脂血症由先天性基因缺陷所致,25,3高脂血症的基因分型法,表10-5 家族性高脂血症的临床特征,26,(二)低脂蛋白血症（自学）,1家族性低-脂蛋白血症,常染色体显性遗传体,2-脂蛋白缺乏血症,常染色体隐性遗传体,3家族性低-脂蛋白血症,常染色体显性遗传体,4Tangier病,常染色体隐性遗传体,(三)脂蛋白代谢紊乱与动脉粥样硬化（自学）,1.致AS的脂蛋白谱：脂质三联征2.代谢综合症：致病四重奏3.HDL-C负相关,27,第二节 血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定,目前临床上开展的血脂测定项目包括TC、TG、HDL及其亚类胆固醇、LDL-C、Lp（a）以及部分载脂蛋白如ApoAI、ApoB等。其中TC、TG、HDL-C、LDL-C测定是血脂测定的四个基本指标。血浆4冰箱中过夜观察其分层现象及清澈度可初步估计各种脂蛋白的变化状况。血浆脂蛋白电泳结合TC、TG水平有助于高脂血症分型。,概况：,28,一、血脂标本的采集与检验质量控制,血脂分析前变异来源于：生物因素，如年龄、性别、种族等因素的个体差异。生活方式，包括饮食习惯、吸烟、运动及应激等。临床方面包括疾病或药物引起的脂代谢改变。血标本采集与处理方面,准确测定应从分析前的准备开始，包括受试者的准备，标本采集，合格的试剂、校准物的选用，检测方法选择。,方法学上应该采用美国疾病控制中心（CDC）或中华医学会检验分会推荐的操作方法。,29,二、血清（浆）静置试验,将患者空腹12h后采集静脉血分离出血清置4冰箱中过夜，然后观察其分层现象及清澈度。,空腹血清混浊，表示TG升高，可放在4冰箱过夜后进一步观察，如果上层出现奶油样且下层清澈，表明CM升高，VLDL正常，可能为I型高脂血症。如果上层出现奶油样且下层混浊，表明CM及VLDL均升高，可能是V型。空腹血清混浊，4冰箱中过夜后仍为均匀混浊，表明VLDL升高，此时应进一步测定TC， TC升高者可能是III或IIb型而TC正常者则可能为型。IIa型高脂血症血清也清澈透明，TC升高 。,正常空腹血清应清澈透明。,30,三、血清（浆）总胆固醇测定,化学法,酶法,31,（一）化学测定法,化学测定法通常需抽提纯化。显色剂主要有两类：醋酸-醋酐-硫酸高铁硫酸。 这些显色反应须用强酸试剂，干扰因素多，准确测定有赖于从标本中抽提、皂化、纯化过程，因而操作较繁，不适于分析大批量标本，且不适于自动分析。,特点：,32,1Liberman-Burchard反应,1885年Liberman发现胆固醇在硫酸、醋酐溶液中显色，1890年Burchard用此反应测定胆固醇称为L-B反应。,1953年Zak提出用硫酸、醋酸和Fe3+等与胆固醇作用生成紫红色化合物来测定胆固醇，称为Zak反应。,2Zak反应,33,(二)酶测定法,特点：,常规测定中现已广泛应用酶法，酶法具有特异性好，精密度和灵敏度都能很好地满足临床实验室的要求，既可以手工操作，也适合自动分析，但酶法测定中出现了不同程度的基质效应。 采用酶反应原理的干化学法颇为实用，其缺点是价格高，精密度差。胆固醇的酶测定法始于70年代。由于操作简便，试剂无腐蚀性，特别适用于自动生化分析，目前已成为测定胆固醇的主要方法。,34,CEH-COD-PAP法,原理： CEH2O FCFFA FCO2 4-胆甾烯酮H2O2 H2O24-AAP酚 醌亚胺H2O,胆固醇酶测定法的试剂中，除了上述三种酶、酚和4-氨基安替比林外，还有维持pH恒定的缓冲液、胆酸钠、表面活性剂以及稳定剂等。胆酸钠是为了提高胆固醇酯酶的活性，表面活性剂的作用是促进胆固醇从脂蛋白中释放出来,35,评价：,主要缺点是：,优点：本法灵敏度高、准确度高、精密度好，线性范围宽。,某些胆固醇酯酶对胆固醇酯的水解不完全，不能用纯胆固醇结晶以有机溶剂配制的溶液作为TC分析的校准液，而应以准确定值的血清作为标准，此校准液（品）相当于三级标准。,表面活性剂，如吐温-40可以干扰胆固醇酯酶的作用，而聚乙烯醇6000可使结果提高12；,本法具有氧化酶反应途径的共同缺陷，易受到一些还原性物质如尿酸、胆红素、维生素C和谷胱甘肽等的干扰。,36,【参考值】,血清总胆固醇合适范围：5.20mmol/L (200mg/dl)，边缘升高：5.235.69mmol/L(201219mg/dl)，升高：5.72mmol/L (220mg/dl)。,37,影响TC水平的因素,年龄与性别；长期的高胆固醇、高饱和脂肪酸和高热量饮食可使TC增高；遗传因素； 其它：如缺少运动、脑力劳动、精神紧张等可能使TC升高。,TC除了作为高胆固醇血症的诊断指标之外，不能作为其它任何疾病的诊断指标，对于动脉粥样硬化和冠心病而言，TC是一个明确的危险因子，与冠心病的发病率呈正相关。,【临床意义】,高TC血症：原发和继发,低TC血症：原发和继发,38,三、血清（浆）甘油三酯测定,化学法,酶法,39,基本操作：,（一）化学测定法,1、抽提：关键是选用合适的抽提剂，既要使甘油三酯提取完全，又要消除磷脂、游离甘油和葡萄糖等干扰物质的影响。 2、皂化：甘油三酯水解生成甘油，这一步大都采用KOH作皂化剂 3、氧化：过碘酸在酸性溶液中将甘油氧化成甲醛和甲酸 4、显色：甲醛的定量主要有两种方法：,甲醛与变色酸(4，5-二羟-2，7-萘二磺酸)在硫酸溶液中加热生成紫色化合物,甲醛与乙酰丙酮在铵离子(NH4+)存在下生成黄色的二乙酰二氢二甲基吡啶,40,(二)酶测定法,1、磷酸甘油氧化酶法（GPO-PAP法）原理 TG + 3H2O LPL Glycerol + 3RCOOH Glycerol + ATP GK+Mg2+ G-3-P + ADP G-3-P + O2 GPO 磷酸二羟丙酮 + H2O2 2 H2O2 + Phenol + 4-Aminoantipyrine POD Chromogen + 4H2O计算 TG（mmol/L）=A500nm测定/A500nm校准 校准血清TG浓度（mmol/L）,41,去除FG干扰可用下列方法：1、外空白法：同时用不含LPL的酶试剂测定游离甘油（FG）作空白。2、内空白法：又称两步法或双试剂法将LPL和4-AAP组成试剂2，其余部分为试剂1。此法目前为中华医学会检验分会推荐方法。,42,2乳酸脱氢酶法,原理： TG + 3H2O LPL Glycerol + 3RCOOH Glycerol + ATP GK+Mg2+ G-3-P + ADP ADP + 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶 丙酮酸 + ATP 丙酮酸+NADH LDH NAD+ + 乳酸,由于反应消耗NADH，故可利用NADH在340nm吸光度降低来测定甘油三脂的浓度。,43,评价：,本法结果准确，但灵敏度较低，试剂也不太稳定。由于血清本身存在游离甘油和丙酮酸等干扰物质，所以测定时除了要做试剂空白外，还要做标本空白,44,3甘油氧化酶法,第一步： FG + O2 甘油氧化酶 甘油醛+ H2O2 H2O2 + EMAE POD 无色物质消除游离甘油的影响，3-5min后进行第二步反应：TG + 3H2O LPL Glycerol + 3RCOOHFG + O2 甘油氧化酶 甘油醛+ H2O2H2O2 +4-AAP+ EMAE POD 有色化合物注：EMAE作用与酚相似，是还原剂，但灵敏度比酚高。,原理：该法分两步完成。,45,血清甘油三酯一般随年龄增加而升高，体重超过标准者往往偏高。 合适范围：1.70mmol/L(150mg/dl)， 升高：1.70mmol/L (150mg/dl)。,【参考值】,46,【临床意义】,原发性高TG血症多有遗传因素，包括家族性高TG血症与家族性型高脂（蛋白）血症等。继发性高TG血症见于糖尿病、糖原累积病、甲状腺机能减退、肾病综合征、妊娠、口服避孕药、酗酒等。大量前瞻性的研究证实，富含TG的脂蛋白是CHD的独立的危险因子，TG增加表明患者存在代谢综合症，需进行治疗。甘油三酯降低比较少见，甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能减退和肝功能严重损伤时可以见到甘油三酯降低,47,五、血清（浆）脂蛋白测定,(一)血清脂蛋白电泳,脂蛋白电泳分析可分为预染法和电泳后染色法两大类。,预染法的操作比较简单，分离效果直观。其操作过程是先将待测血清和苏丹黑染料按一定比例（9:1）混合进行预染处理，离心后取上清液进行电泳分析。,电泳后染色法为用电泳方法先将血浆脂蛋白各成份分开，再用苏丹黑或油红O进行染色。,临床上比较常用的是预染法电泳。,48,血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳：-脂蛋白：0.30-0.40，前-脂蛋白：0.13-0.25，-脂蛋白：0.50-0.60，乳糜微粒：阴性。,【参考值】,49,（二）高密度脂蛋白测定,常以测定HDL-C含量代表HDL水平。,参考方法:,超速离心分离HDL，然后用化学法（ALKB法）或酶法测定其胆固醇含量，此法需特殊设备，而且不易常握。,50,常规方法:,1磷钨酸-镁法,2HDL直接测定法,HDL直接测定法大致分三类，分别是:聚乙二醇/抗体包裹法酶修饰法选择性抑制法，又称掩蔽法，,51,HDL-C合适范围：1.04mmol/L (40mg/dl), 0.91mmol/L (35mg/dl)为减低。,【参考值】,【临床意义】,流行病学与临床研究证明，HDL-C与冠心病发病呈负相关，HDL-C低于0.9 mmol/L 是冠心病危险因素。HDL-C大于1.55mmol/L被认为是冠心病的“负”危险因素。 HDL-C下降还多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬化病人。高TG血症往往伴以低HDL-C，肥胖者的HDL-C也多偏低。吸烟可使HDL-C下降，适量饮酒、长期体力劳动和运动会使HDL-C升高。,52,（三）低密度脂蛋白胆固醇测定,1Friedewald公式法 LDL-CTCHDL-CTG/5（以mg/dl为单位时），或LDL-CTCHDL-CTG/2.2（以mmol/L为单位时）。,2聚乙烯硫酸盐沉淀法 本法并非对LDL-C作直接测定，而是用聚乙烯硫酸（PVS）选择性沉淀血清中LDL，再以血清TC减去上清液（含HDL与VLDL）胆固醇即得LDL-C值。,3直接测定法:两类,目前各类方法测定的LDL-C值都包括IDL和LP(a)的chol在内,53,LDL-C合适范围：3.12mmol/L (120mg/dl)， 边缘升高：3.153.61mmol/L(121139mg/dl) 升高：3.64mmol/L (140mg/dl)。,【参考值】,【临床意义】,LDL-C增高是动脉粥样硬化发生发展的主要脂类危险因素。由于TC水平同时也受HDL-C水平的影响，所以最好以LDL-C代替TC作为冠心病危险因素指标。美国国家胆固醇教育计划成人治疗专业组规定以LDL-C水平作高脂蛋白血症的治疗决策及其需要达到的治疗目标。,54,（四）脂蛋白(a)测定,Lp(a)测定有两类方法,一是以免疫化学原理测定其所含Apo(a)，结果以Lp(a)质量表示，也有以Lp(a)颗粒数mmol/L表示的。 另一类方法测定其所含的胆固醇，结果以 Lp(a)-C表示。目前大都用免疫学方法测定。,55,正常人群的Lp(a)水平呈明显的正偏态分布，大多在200mg/L以下，平均数在120180 mg/L，中位数约100mg/L。Lp(a)水平高于医学决定水平（300mg/L），冠心病危险性明显增高。,【参考值】,【临床意义】,血清Lp(a)水平是动脉粥样硬化