陕西省烟草灰霉病病原及云芝多糖对其防治研究

落 | t |一| 。一I jwxtim accn15 20 3 l 6韪 链 ll l Http：journalsim：ac：cnMycosysteISSN1672；472 CNii：5180Q2013 IMCAS；1t羲棼她 哪n 陕西省烟草灰霉病病原及云芝多糖对其防治研究 李金岭 罗晶 单宏英 成巨龙 陈德鑫。 安德荣 西北农林科技大学植物保护学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室陕西杨凌7121 00 陕西省烟草研究所陕西西安71 0000 中国烟草总公司青州烟草研究所山东青岛266001 摘要：采用形态学观察和分子鉴定方法对2011年在陕西省发生的一种烟草未知病害的病原菌进行鉴定。从病叶组 织分离纯化得到病原菌，通过致病性测定以及人工接种后再分离病菌，证明编号LJL007的菌株为该病的致病菌。依 据病原菌的形态学和培养特征，将菌株LJL007鉴定为灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers，其有性型为富氏葡萄孢盘菌 Botryotiniafuckeliana Whetzel。通过核糖体DNA ITS序列分析，分离菌株LJL007序列(登录号：HM17900)与富氏 葡萄孢盘菌序列(登录号：HM849615)同源性达100，进一步证明该病原菌是灰葡萄孢Botrytis cinerea。云芝多糖 在离体条件下，对灰葡萄孢的菌丝生长和孢子萌发均无直接抑制作用。云芝多糖对烟草灰霉病有较好预防保护作用， 其预防效果可达5629。云芝多糖可显著提高烟草体内几丁质酶和B1，3葡聚糖酶活性，其活性峰值分别比对照提 高5689和42983，说明云芝多糖可诱导植物产生抗病性。 关键词：灰葡萄孢，形态学，rDNA-ITS序列，防御酶，诱导抗病性 Causal agent of tobacco gray mould in Shaanxi Province and J ，- 0 0 0 0 0 0 DreVentlve etieCtS Ot，厂amefeS verstCO10厂polysaccnarides 0n the disease LI JinLing LUO Jing SHAN HongYing CHENG JuLong2 CHEN DeXin AN DeRong College ofPlant ProtectionState Key Laboratory ofCrop Stress Biologyfo，AridAreasNorthwest AgricultureForestry University, Yangling,Shaanxi 712100,China Shaanxi Tobacco Research Institute，Xion，Shaanxi 710000,China Qingzhou Tobacco Research Institute ofChina National Tobacco Corporation，Qingdao，Shandong 266001，China Abstract：Based on morphological characters and molecular data，the pathogenic fungus of an unknown tobacco disease in 基金项目：全国烟草有害生物调查研究项目(NoKJ一201014)；新型杀菌剂真菌多糖在烟草病害防治中的研究和应用(No110201002024) Corresponding authorE-mail：anderong323163c0m 收稿日期：20120422，接受日期：201210 30 擎金嫡售 Shaanxi Province in 20 1 1 was identifiedThe suspected pathogen was isolated from diseased leaves of tobacco plants，and after pathogenicity tests and reisolation of the pathogen，the strain LJL007 was determined to be responsible for the disease The strain LJL007 was identified as Botrytis cinema，whose teleomorph is Botryotiniafuckeliana on basis of morphological and cultural charactersWe found that the sequences ofthe isolate LJLO07(Accession no：HM17900)was 100identical to that of Bfuckeliana(Accession no：HM8496 1 5)by analyzing sequences of the ITS regions of ribosomal DNA，further confirming that the pathogen was Botrytis cinemaTrametes versicolor polysaccharides cannot inhibit the mycelium growth and spore germination of Botryt&cinerea on potato dextrose agarHowever，the polysaccharides had relatively good preventive effects on tobacco gray mould in the field，preventive effectiveness was 5629The results of enzyme activity tests showed that Trametes versicolor polysaccharides significantly enhanced activities of chitinase and 3-1，3-glucanase in the tobacco plants after treatment，the peak values of them increased by 5689and 42983as compared to the control treatment ftreatment A：only spraying stilled water on the tobacco)respectivelyThese resuks indicated that Trametes versicolor polysaccharides could induce and improve resistance of tobacco plants to gray mould Key words：Botryt&cinerea，morphology，rDNA-ITS sequence，protective enzyme，induce resistance 烟草Nicotiana tabacum L是我国重要的经 济作物，在国民经济中占有重要地位。由于受 气候变化、地理分布、耕作栽培制度、烟草品 种变化等因素的影响，烟草病害频繁发生。2011 年在陕西洛南等地烟田发生了一种未知病害， 该病害发生在烟草生长后期，受害烟株下部叶 片出现较大面积灰褐色病斑，部分病斑可扩大 到半个叶片以上，病部表面布满浓密的浅灰色 霉层。天气晴朗时病斑干枯变脆、破碎，形成 大的穿孔，罹病烟叶失去采收价值。该病害在 洛南当地平均发病率高达276-497，发生 扩展的速度非常快，给烟草生产造成严重损失。 本研究对病斑的发病组织进行分离和培养 纯化，根据病原菌形态学、病原菌致病性，并 结合病原菌rDNAITS序列和同源性分析 (Staats 2005；Sun et a12009)对致病菌进行鉴 定，从而明确该病害致病菌的种类和分类地位。 为有效控制该病害，本文还进行了利用云 芝多糖对烟草灰霉病防治的研究。云芝多糖是 从担子菌杂色云芝菌Trametes versicolor(L) Lloyd中提取的水溶性多糖(王俊明等2004)。 大量临床及医学研究表明，云芝多糖具有免疫 调节功能，可显著提高动物免疫力，但云芝多 糖是否能应用于抗植物病原菌目前鲜有报道。 本试验尝试进行云芝多糖对烟草灰霉病的防治 研究，测定施用云芝多糖后烟草体内B1，3一葡聚 糖酶和几丁质酶的变化，为烟草灰霉病的防治 提供理论和实践依据。 1材料与方法 11材料 111供试烟草品种：普通烟K326由陕西省烟 草研究所提供。 112供试培养基及供试药剂：PDA培养基按 方中达(1998)所述方法配制；615云芝多糖 由本实验室提取、制备和纯化，并于铝箔袋密 封室温保存备用；10苯醚甲环唑散粒剂WG， 瑞士先正达作物保护有限公司；05香菇多糖 菌物学报 固 tSSNI672,6472 cml518oQ坳 舢 | 322 AS，浙江方格药业有限公司；05氨基寡糖素 AS，广西北海国发海洋生物农药有限公司。 12方法 12I病样采集与病原菌分离纯化：201 1年810 月先后4次在陕西洛南烟田对典型病害进行采 样。采用常规组织分离法对病原菌进行分离(方 中达1998)；用单孢分离法对病原菌进行纯化 (方中达1998)，获得供试菌株。 122致病性检测：按照柯赫式法则，采用针刺 接种法(Sun et a12009)接种，接种部位用保 鲜膜包裹，接种后的烟株室温内喷雾保湿3d培 养，逐日观察并记录发病症状。同时接种空白 的PDA或无菌水作为对照，每处理3次重复。 待接种烟株发病后，按照上述121的方法从病 斑上再次分离病菌。 123菌株形态特征观察：将菌株接种于PDA 平板上，25黑暗条件下培养，待菌落基本形 成后，观察菌落颜色、形状、菌丝的疏密程度 等；待菌落产孢后，在Olympus BX51显微镜 下观察其产孢结构、分生孢子的形态，并进行 显微照相。根据病原菌的产孢特征及其在PDA 培养基上的形态特征，参照张中义(2006)的 方法进行病菌鉴定。 124病原菌的分子鉴定：采用Cenis(1992) 和Lu a1(2004)的方法提取菌体基因组DNA (萨姆布鲁克2002)。采用通用引物ITS1ITS4 扩增病菌rDNA的ITS片段(Sun eta12009)， 引物序歹0为ITS 1(5 TCCGTAGGTGAACCTGC GG一3 )和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATAT GC一3 )。PCR产物经l琼脂糖凝胶电泳检测 后，由上海生工生物工程技术服务有限公司进 行测序，将得到的序列在GenBank数据库中进 行同源性比较(任小杰等2008)。通过同源性 分析，对病原菌进行分子水平鉴定。 125云芝多糖对灰葡萄孢的抑制作用：供试病 菌在PDA培养基上生长5d后，将菌饼分别接 种到含o、o2、o4、o6、08、1o、12mgmL 云芝多糖PDA平板上，每浓度5皿，3d用十 字交叉法测量菌落直径，计算其菌丝生长抑制 率；培养10d待其大量产孢后，用20mL无菌 水洗下孢子，在显微镜下用血球计数板检测其产 孢量(陆家云2001)，计算其孢子萌发抑制率。 菌丝生长抑制率()=(对照菌落直径一处理菌 落直径)对照菌落直径1100 孢子萌发抑制率=f(对照菌落孢子数一处理菌落孢 子数)对照菌落孢子数】100 126云芝多糖对烟草灰霉病的预防保护作用： 设置4个处理：处理1：05mgmL香菇多糖AS 300倍；处理2：12mgmL云芝多糖AS；处理 3：625mgmL氨基寡糖素AS 500倍；处理4： 01mgmL苯醚甲环唑散粒剂WG 300倍。选取 7叶期长势一致的普通烟K326，用上述4个处 理对烟草进行叶面喷施处理，空白对照烟草喷 施灭菌水，每处理6次重复。每5d喷施1次， 共喷施4次，最后1次喷施5d后在处理烟草的 叶片上采用菌饼法接种，烟株置于温度24、 相对湿度大于90的温室内。接种后3、5、7d， 分别测量烟叶病斑面积并计算预防效果。 预防效果=(对照叶片病斑面积一处理叶片病斑面 积)对照叶片病斑面积xl00 127云芝多糖对烟草灰霉病的治疗作用：选取 7叶期普通烟K326采用菌饼法接种，设置与 126中相同4个处理，接种后3、5d分别对处 理组烟叶喷施上述4种药剂，喷施灭菌水为对 照，每处理6次重复，其他试验条件同126。 接种后第5、7天后分别测量烟叶病斑面积并计 算治疗效果。 治疗效果=(对照叶片病斑面积一处理叶片病斑面 积)对照叶片病斑面积1100 -| 。|0| ： 誊誓囊| ； * 嗡 酶惜晒麓 喁_韶 128云芝多糖对烟草D一1，3一葡聚糖酶和几丁质 酶活性的影响：云芝多糖诱导处理：选取7叶 期长势一致的烟K326分别采用如下4种处理方 法处理烟株，处理A：只喷清水；处理B：单 喷12mgmL云芝，不接种病原菌；C：喷施 12mgmL多糖后接种病原菌；D：不喷施云芝 多糖，只接种病原菌。处理烟株置于温室内(温 度24，相对湿度大于90)。分别在处理后1、 3、5、7、9d取烟草叶片进行各项指标测定。 酶液提取：参照孙斌等(2004)的方法提取B1，3一 葡聚糖酶，参照余永廷等(2007)的方法测定 B1，3葡聚糖酶的活性，以每克鲜组织每分钟催 化昆布多糖产生llxg葡萄糖的酶量为一个酶活 力单位U。几丁质酶的提取：参照Boiler(1983) 的方法提取几丁质酶。胶态几丁质的制备参照 Berger&Reynolds(1958)和刘亚光等(2003) 的方法，以每分钟生成lpmol N乙酰氨基葡萄 糖所需的酶量为一个酶活力单位u。 13数据分析 全部数据采用SPSS 1 70软件进行处理，多 重比较采用LSD多重比较法进行差异显著性检 验分析。 2结果与分析 21病害症状及病原菌分离 该病害主要为害烟草叶片，少数可侵染茎 部。烟叶病斑深褐色，近圆形或不规则形，正 面呈现清晰轮纹，直径1215cm；部分病斑表 面密布一层浅灰色霉层；后期部分叶斑干枯变 脆、破碎，形成大的穿孔(图l-A)。茎部病斑 灰褐色，长圆形，较小，直径5-8cm，稍凹陷 (图lB)。 采用常规组织分离法，对病原菌进行分离， 经单胞纯化，获得一个纯化菌株，将该菌株命 名为LJL007。 22致病性测定 用菌株LJL007进行回接试验，接种叶片和 茎秆在第3天时开始出现病斑。病斑灰褐色， 近圆形，随后扩展形成深褐色水浸状病斑，病 斑内侧近圆形浅褐色有不清晰轮纹，外侧暗褐 色呈不规则形，且互相融合形成大的病斑并沿 主脉和侧脉发展，其发病症状与自然发病的病 斑相似(图1C，D)，清水对照植株生长状态 良好。再次从接种烟株病斑分离纯化致病菌， 获得了与原接种菌株相同的病原菌，证明菌株 LJL007与洛南县发病烟株上病原菌为同一病 原菌。 23病原菌鉴定 231病原菌形态特征：菌落在PDA培养基上 生长速度快，呈放射状生长，菌丝初期为白色， 4d后菌落平均直径达72mm(图2-A)，菌落边 缘呈绒毛状；培养7d菌落平均直径达89ram， 菌丝呈灰褐色(图2B)，在显微镜下观察，菌 落开始产生少量分生孢子，10d大量产生孢子； 15d后在培养基上出现黑色菌核，大小 2 l mm，表面光滑、有光亮，小型颗粒聚 集成球形或不规则形，散生在菌落边缘。 分生孢子梗丛生，细长，1473lOx 128187岬，淡褐色，具隔膜，顶端有分枝， 分枝的末端膨大，其上有许多小梗，分生孢子聚 生在分生孢子梗上，外观呈葡萄穗状(图3-A)； 分生孢子单胞，卵圆形或近球形，表面光滑， 无色(图3B)。自然侵染条件下分生孢子大小 为8108x5106LLm，在人工培养基上则为 82148x65115um，略大于自然状态下产生 的分生孢子。根据以上特征参照张中义(2006) 的描述，我们初步将该病害的病原菌确定为灰 葡萄孢 0 tis cinerea Pers。 菌物学报 瞄I ISSN。1672-66472 C N、11-5_、18 0tQ 一 M 、 n N 比对，序列相似性大于99的，鉴别为相同种 (Giraud et a11997)。灰葡萄孢 D tis cinerea Pers的有性型即为富氏葡萄孢盘菌Botryotinia fuckeliana(张中义2006)。根据菌株LJLO07 的ITS序列同源性分析结果，我们进一步确定 菌株LJLO07为灰葡萄孢BD tis cinerea。 24云芝多糖对烟草灰霉病的预防与治疗效果 24,1不同浓度云芝多糖对灰葡萄孢 D cinerea抑制作用：在实验条件下，不同浓度云 芝多糖对灰葡萄孢的抑制作用见表1，云芝多 糖各个处理浓度3d后的菌落直径、孢子萌发量 与对照均无显著差异，说明云芝多糖对灰葡萄 孢B0 tis cinerea的菌丝生长和孢子萌发无直 接抑制作用。 242云芝多糖对烟草灰霉病预防保护作用：4 种药剂处理烟草叶片的病斑面积均小于对照 (表2)，说明云芝多糖与其他3个对照药剂均 对烟草灰霉病有一定预防保护作用。12mgmL 云芝多糖处理在3、5和7d对灰霉病的预防效 果分别达到3327、3924和5629，预防 效果呈上升趋势；且12ragmL云芝多糖处理在 3、5和7d时预防效果显著高于(P005)其他 3种对照药剂防效。表明12mgmL云芝多糖对 烟草有较好的保护作用。 243云芝多糖对烟草灰霉病治疗作用：在4种 药剂中，01mgmL苯醚甲环唑散粒剂对烟草灰 霉病有较好的治疗作用，5d和7d对烟草灰霉 病的治疗效果分别为2993、401l，而 12mgmL云芝多糖在5d和7d对烟草灰霉病的 治疗效果分别为2493、3624，显著显低于 (P005)01mgmL苯醚甲环唑的治疗效果 (表3)，表明云芝多糖对烟草灰霉病的直接治 疗作用不明显。 244云芝多糖对烟草植株几丁质酶活性的影 响：云芝多糖可迅速提高烟叶中几丁质酶的活 性，其中施用云芝多糖再接种处理组在1d内几 表1云芝多糖对灰葡萄孢8otrytis cnerea的抑制作用 Table I Test for inhibition of Trametes versicolor polysaccharides on Botrytis cinema 注：表中数据为3次重复的平均值标准误同列数据后，不同小写字母表示各处理经LSD多重比较在P=005水平差异显著 Note：Data in each colmnn are the meanSE of three replicatesMeans followed by different letters in each column are significantly different at P=005 by LSDS multiple comparison 蠢薯誊l甏|叠警 警鸳 j 蠹 秀警鼍 |燕堂奎童蛊童立0 0譬00叠盖 0 童-00 -0 -00 山 一 表2云芝多糖对烟草灰霉病的预防作用 O5mg，mL香菇多糖As 300倍；处理2：12mgIl1L云芝多糖As；处理3：625m mL氨基寡糖素As 500倍；处理4：O1mgmL苯醚甲环 唑散粒剂WG 300倍表3同 Note：Data in each c。1umn are the mean士SE。f three replicatesMeans followed by different 1etters in each c。l唧n are significant1y di恤rent at P=-005 by LsD，s mu1tiple comparis0nTreatmem 1：O 5mgmL lentinan AS 300 ；treatrnent 2：l，2mgmL乃 e 口 p。lysaccharide As； treatment 3：625mgmL。1ig。sacchariasAS 300 ；treatment4：01mgmLdifenocollaz。1ewG 50O 1ab1e 3i。me ame 表3云芝多糖对烟草灰霉病的治疗作用 菌物学报 -I 672-6472 CNII-5 180Q 哦一 u s， n 32 2 丁质酶活性就达最大值，且该峰值比对照提高 5689；同时施云芝多糖不接种处理组其叶片 几丁质酶活性也明显高于对照组。而不施药接 种处理组几丁质酶活在第3天达到最大值，表 明云芝多糖可迅速提高烟苗体内几丁质酶的活 性(图5)。 图5云芝多糖对烟草植株几丁质酶活性影响 A：只 喷无菌水；B：单喷云芝多糖，不接种灰葡萄孢；C：喷施多糖后 接种灰葡萄孢；D：不喷施多糖，只接种灰葡萄孢 Fig5 Dynamics of chitinase in leaves of tobacco treated with Trametes versicolor polysaccharidesA：Spraying stilled water on the tobacco；B：Spraying Trametes versicolor polysacchafides on tobacoo without inoculation with Botrytis cinema；C：Spraying Trametes versicolor polysaccharides on tobacco before inoculating with Botrytis cinema；D：Inoculating with Botrytis cinema without spraying Trametes versicolor polysaccharides 245云芝多糖对3-1，3葡聚糖酶活性的影响： 喷施多糖再接种和喷施多糖不接种两组处理 中其叶片中B1，3葡聚糖酶活性均明显高于对 照组和不喷药接种处理；喷施多糖后接种处理 在第5天内Bl，3葡聚糖酶活性达最大值，且 该峰值比对照值提高42983，表明云芝多糖 可显著提高烟株体内B1，3一葡聚糖酶的活性 (图6)。 蜒 避 耱 婶 韫 图6云芝多糖对烟草植株B一1，3一葡聚糖酶活性影响 A：只喷无菌水；B：单喷云芝多糖，不接种灰葡萄孢；C：喷施 多糖后接种灰葡萄孢；D：不喷施多糖，只接种灰葡萄孢 Fig6 Dynamics of 3-l-3-glucanase in leaves of tobacco treated with Trametes versicolor polysaccharidesA：Spraying stilled water on the tobacco；B：Spraying Trametes versicolor polysaccharides on tobacoo，without inoculation with Botrytis cinema；C：Spraying Trametes versicolor polysaccharides on tobacco before inoculating with Botrytis cinema；D：Inoculating with Botrytis cinema without spraying Trametes versicolor polysacchafides 3讨论 随着分子生物技术的发展，rDNAITS序列 分析己被广泛应用病原真菌的鉴定、分类和系 统发育研究。本实验应用rDNAITS分子标记 分析和传统形态学鉴定相结合的方法，证明在 陕西发生烟草未知病害为烟草灰霉病，其病原 菌为灰葡萄孢 D ts cinema。烟草灰霉病于 1981年首次在日本黄花烟草上发现，目前我国 仅在贵州毕节有报道发生(Wang 2011)。这是 在陕西省内首次发现烟草灰霉病的发生，鉴于 该病害在洛南当地造成较大的经济损失，应对 一 誊|学 雾 该病害防治引起高度重视。 本研究发现，云芝多糖对灰葡萄孢的菌丝 生长和孢子萌发均无直接抑制作用。但云芝多 糖对烟草灰霉病具有较好的预防保护作用，其 在3、5、7d的预防效果分别达到3327、3924 和5629，均显著高于其他3种供试药剂。试 验还发现，对烟草植株施用云芝多糖后，烟草 体内几丁质酶和3-1，3一葡聚糖酶活性都有显著 提高，几丁质酶和Bl，3一葡聚糖酶活性峰值分别 比对照提高5689和42983。而已有的研究 表明，B1，3葡聚糖酶可破坏由3-1，3葡聚糖组 成的真菌细胞壁而抑制病原菌；几丁质酶通过 破坏真菌菌丝尖端新合成的几丁质而抑制病原 菌的生长，这两种酶在植物的抗病反应中起着 十分重要的作用(左豫虎等2009)。结合本文 实验结果，推测云芝多糖在防治烟草灰霉病方 面可能起到激发子的作用，在进入烟株体内以 后诱导激发烟株对病原菌的防御反应，提高烟 株体内几丁质酶和D一1，3葡聚糖酶等抗病相关 酶的活性水平，使植物体内PR蛋白含量增高并 产生植保素等抗菌物质，从而提高了烟株的抗 病性。有关云芝多糖诱导烟草抗烟草灰霉病的 机理还有待深入研究。 【REFERENCES】 Berger LR，Reynolds DM，1 958The chitinase system of a strain of Streptomyces griseusBiochinica et Biophysica Acta， 29(3)：522534 Boiler Gehri A，Mauch F1983Chitinase in bean leaves： induction by ethylene，purification，properties，and possible functionPlanta，157(1)：2231 Cenis JL1992Rapid extraction of fungal DNA for PCR amplificationNucleic Acids Research，20：2380 Fang ZD，1998Method of plant pathology3rd 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