厌氧菌

第十五章厌 氧 菌,第一节 概念、种类与分布 是指一大群在有氧条件下不能生长，必须在无氧条件下才能生长的细菌。主要可分为两大类，一类是有芽胞的G+梭菌，另一类是无芽胞的G+及G-杆菌与球菌。,无芽胞厌氧菌在临床厌氧菌标本检出率中约占90,分布广泛，多为条件致病菌；厌氧菌的感染遍及临床各科，且多为混合感染；对氨基糖甙类抗生素耐药，而对甲硝唑(灭滴灵)普遍敏感, 40多个菌属，300多个菌种。有芽胞厌氧菌只有梭菌属，共130个种。,无芽胞厌氧菌同需氧菌与兼性厌氧菌共同构成机体的正常菌群,其中厌氧菌占有绝对优势，例如肠道菌群占999。正常情况下菌群之间保持着微生态平衡，厌氧菌代谢产生的乙酸、乳酸等能抑制病原菌生长。如长期使用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等，在发生菌群失调或机体免疫力下降或细菌进人非正常寄居部位时，这些厌氧菌即可作为条件致病菌而导致内源性感染。,(一)厌氧菌感染的条件,1.组织缺氧或氧化还原电势(Eh)降低可造成厌氧菌生长的适宜环境，易于遭受厌氧菌感染。2.机体免疫功能下降，如老年人、早产儿, 接受免疫抑制剂、抗代谢药物、放射或化疗治疗的患者，其全身免疫功能受损或降低，厌氧菌感染率相当高。,3.长期应用氨基糖甙类抗生素，或长期应用头孢菌素、四环素等无效者，均可诱发厌氧菌感染。4.需氧菌、兼性厌氧菌的混合感染。需氧菌生长耗竭了氧气，有利于厌氧菌的生长。,(二)厌氧菌感染临床细菌学指征,1.感染局部产生气体，组织肿胀和坏死。2.粘膜附近的感染。3.深部外伤的继发感染，流产胃肠手术后发 生的感染。,4.分泌物有恶臭，或为暗血红色，并在紫外 光下发出红色荧光。 5.分泌物涂片镜检有细菌，而常规培养阴性 者；或在培养基深部长的细菌。6.长期应用氨基糖甙类抗生素治疗无效病例。,第二节厌氧性细菌的检验,(一)采集标本 不能被正常菌群污染；应尽量避免接触空气。最理想是能取得组织标本。 下列标本无送检价值，不宜做厌氧菌培养：鼻咽拭子；齿龈拭子；痰和气管抽取物；胃和肠道内容物、肛拭；接近皮肤和粘膜的分泌物；褥疮溃疡及粘膜层表面；排出的尿或导尿；阴道或子宫拭子；前列腺分泌物。 标本运送中应尽量避免接触空气。不要冷藏 。,(二)直接涂片染色镜检,结合标本来源，性状与气味，可提供许多有用的信息,对估计标本中含菌量、细菌种类和选择培养基等都有意义 。标本发臭，镜检发现细菌染色不均，形态奇特者常是厌氧菌的表现 。 如两端钝圆着色深，中间着色浅不均匀，且有空泡，长短不一的革兰阴性杆菌常脆弱类杆菌。,标本呈琥珀酸味，带血性或用紫外灯照射发红色荧光，涂片镜检为G-球杆菌，间或有长短不一的多形性，并有恶臭者，常为产黑色素普雷沃菌。 菌体细长，两端尖, 为梭形的G-杆菌，有紫色颗粒沿菌体长轴排列，成双排列尖端相对，并有丁酸臭味者，常是具核梭杆菌。 菌体高度多形性，长短不一，菌体中部肿胀或呈圆球者，可能是坏死梭杆菌 。,极小的G-球菌，可能是韦荣球菌。 G+无芽胞杆菌，呈乳酸气味者，可能是乳酸杆菌。呈丙酸气味者，并有特殊排列呈X、Y、或栅状者可能是痤疮丙酸杆菌。 有醋酸气味的可能是双歧杆菌。 菌体分枝，呈棒状或栅状排列，且发现黄色颗粒，有琥珀酸气味者，多是放线菌。,G+芽胞杆菌，肯定是梭状芽胞杆菌属。 G+短粗两端钝圆杆菌，无芽胞，中性粒细胞也很少且变形破碎，标本来自战伤或肢体严重肿胀者，大多是产气荚膜梭菌。 G+杆菌，有芽胞，并有异丁酸或异戊酸等气味，标本来自抗生素相关性肠炎者，大多是艰难梭菌。,（三）厌氧菌培养基,1)强化血琼脂平板(BAP)： 即布氏琼脂或牛心、牛脑浸出液琼脂为基础培养基，补加酵母浸膏(05)、动物血(510)、维生素k1(0.1gml)和氯化血红素(5gml)，是一种非选择性培养基，几乎能培养出所有的厌氧菌。,2)卡那万古霉素冻溶血琼脂平板(KVLB)： 可抑制大多数兼性厌氧菌，使产黑色素普雷沃菌早期形成黑色素。只需23d出现黑色菌落。绝大多数类杆菌属、普雷沃菌属和紫单胞菌属都生长良好，梭杆菌和厌氧球菌不能生长。是常用的选择性培养基。卡那霉素含量为75100gml，万古霉素为75gml。,3)七叶苷胆汁平板(BBI)：本培养基含20胆汁，1gL七叶苷和100gml的庆大霉素。抑制需氧菌，胆汁抑制对之敏感的厌氧菌。只有耐胆汁的脆弱类杆菌与可变梭杆菌和死亡梭杆菌不被抑制，反被刺激菌落较大，还能水解七叶苷，菌落周围有棕黑色的晕。,4)卵黄平板(EYA)和兔血平板：用于选择产气荚膜梭菌，标本接种兔血平板，见有双溶血环，内环是与菌落一样大小的透明溶血，外环是宽的甲型溶血，放半小时后菌落变绿色或褐色，同时可接种卵黄平板，以进行卵磷脂酶试验鉴定产气荚膜梭菌。,(四)厌氧菌培养常用方法,1)厌氧罐培养法：应用物理或化学方法造成无氧环境。如冷触媒法：利用气体发生器产生氢及二氧化碳，产生的氢在触媒作用下，与罐内的氧结合成水，将氧消耗掉，造成无氧环境。产生的二氧化碳约为10，也适宜厌氧菌生长。方法为：先将触媒(金属钯或铂)及美蓝指示剂放入罐内，然后将已接种的平板置于罐内，将气体发生袋的指定角剪开，加入lOml水，立即放入罐内，封闭厌氧罐即可。,2)气袋法：原理相同，只是将厌氧罐用无毒、透明的塑料袋代替。 3)厌氧手套箱培养法：厌氧手套箱公认的培养厌氧菌最佳仪器。它是密闭的大型金属箱，前面有透明面板，板上装两个手套，可通过手套在箱内进行操作。适用于在无氧环境中连续进行标本接种、培养和鉴定等全部工作。,(六)鉴定试验,据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性等作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等项检查。 1形态与染色 不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同时也为鉴定厌氧菌提供参考依据。,2菌落性状,不同厌氧菌其菌落形状和性质不同。梭菌的菌落特点是形状不规则，而无芽胞厌氧菌多呈单个的圆形小菌落。 (1)色素：产黑色素普鲁沃菌产生黑褐色或黑色色素。龋齿放线菌产生粉红色色素。奈氏放线菌产生黄褐色色素：,(2)溶血：产气荚膜梭菌在新鲜血琼脂平板形成双溶血圈。 (3)荧光：产黑色素普鲁沃菌在紫外线灯下，显示砖红色荧光；梭杆菌常发生黄绿色荧光；艰难梭菌发生绿色荧光。,3耐氧试验,当在厌氧平板上有菌生长时，为确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。 4药物鉴定试验 用于鉴定厌氧菌的抗生素有卡那霉素和灭滴灵。卡那霉素的敏感性叮将梭杆菌属与类杆菌属区分开，大多数类杆菌对卡那霉素耐药：灭滴灵纸片在鉴别厌氧菌(敏感)与非厌氧菌(不敏感)有重要意义 。,5聚茴香脑磺酸钠试验,厌氧消化链球菌对50gL的聚茴香脑磺酸钠溶液敏感，而绝大多数其他G+球菌耐药。,6生化特性鉴定,主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂肪酶试验、蛋白溶解试验、明胶液化试验及胆汁肉汤生长试验和硫化氢试验等。为简化厌氧菌鉴定，有多种试验鉴定系统，如推测性平皿系统等。虽然不完善，但可使厌氧菌的鉴定标准化，自动化。,7气液相色谱技术(GLC),应用GLC分析厌氧菌的终末代谢产物，因各种厌氧菌的代谢产物不同，故已成为鉴定厌氧菌及其分类的比较可靠的方法可在数十分钟至数小时即可作出诊断。,8PCR,如采用PCR方法检测抗生素相关性腹泻病人粪便中艰难梭菌的毒素基因阳性率高达828，明显高于厌氧培养法的检出率192，且与厌氧培养法的一致性为 100。,9基因探针,如用地高辛标记脆弱类杆菌的基因探针，检测标本中的脆弱类杆菌其敏感性为89，特异性为917，检测灵敏度为10pgDNA，故其特异性强，敏感性和灵敏度均高，并具有快速简便的优点。,(七)检验结果分析与报告,根据革兰染色镜检，菌落性状、耐氧试验及药敏试验若发现厌氧菌可初步报告：“检出厌氧菌，形似x x x菌”； 再根据生化反应及终末代谢产物作最终报告：“分离鉴定出x x x菌”及“药物敏感试验： x x x结果”。 有条件的单位可采用基因探针或PCR技术，快速准确的检测厌氧菌。,第三节 厌氧球菌,在临床标本中检出的厌氧菌大约有25为厌氧性球菌。其中G+消化球菌和消化链球菌属以及G-韦荣球菌属与临床感染相关。,、消化球菌属,黑色消化球菌是消化球菌属中惟一的菌种。通常寄居在人的体表和与外界相通的腔道中，是人体正常菌群。在临床上可引起人体各部组织和器官的感染，常与其他细菌混合感染，如腹腔感染、肝脓肿等。,微生物特性,菌体圆形，排列成双、短链或成堆。生长缓慢，厌氧培养24d才形成黑色不溶血的小菌落，接触空气后颜色变浅，传代后黑色消失，通过庖肉培养后又可产生黑色素。不发酵糖，触酶阳性为其特点。对青霉素、红霉素、氯霉素、洁霉素、四环素及灭滴灵敏感。DNA的G+C为5051mol。,微生物检验,从感染部位采集标本，作直接涂片镜检和分离培养。接种血琼脂平板，并同时接种含血清硫乙醇酸盐培养基或庖肉培养基(增菌培养)，经厌氧培养24d后，观察菌落形态，革兰染色观察菌体形态和排列作出初步报告。据生化反应、抗生素纸片敏感试验以及气液相色谱分析代谢产物作出最后报告。,二、消化链球菌属,分成厌氧消化链球菌、不解糖消化链球菌、吲哚消化链球菌、大消化链球菌、微小消化链球菌、普氏消化链球菌、产生消化链球菌、四联消化链球菌与天芥菜春还原消化链球菌等9个菌种，其代表菌种为厌氧消化链球菌。主要依据是DNA的G+C为27-45mol。,临床意义,以厌氧消化链球菌最常见，产生消化链球菌则很少见。消化链球菌可引起各部组织和器官感染，又以混合感染为多见，如腹腔感染、肝脓肿、外阴、阴道及盆腔感染、肺部和胸膜感染、口腔感染、颅内感染以及皮肤和软组织感染等。,厌氧消化链球菌可与金黄色葡萄球菌或溶血性链球菌协同引起严重的创伤感染，即厌氧链球菌肌炎。该菌常可引起细菌性心内膜炎，主要由原发病灶口腔、牙周和尿道感染而引起。致菌血症较少见。在临床标本分离株中，本菌属占2035，为第2位，仅次于脆弱类杆菌。,微生物特性,为G+球形或卵圆形，成双或呈短链状排列。无鞭毛。在35-37pH7-75时生长佳。在厌氧血平板上，菌落1mm，灰白色凸起、不透明边缘整齐，不溶血。在硫乙醇酸钠液体培养基中，呈颗粒状沉淀生长。吐温-80促进生长。触酶阴性，发酵葡萄糖不发酵乳糖，不水解胆汁七叶苷，吲哚、尿素酶、硝酸盐还原试验均为阴性，对多聚茴香磺酸钠敏感。,微生物检验,检查方法与检查黑色消化球菌基本相同。本菌培养物常有恶臭气味，为其特点。可通过形态、染色、培养特性、生化反应发酵葡萄糖产酸，分解甘露醇等与黑色消化球菌鉴别。,三、韦荣球菌,韦荣球菌属为革兰阴性厌氧球菌，有7个种，其中小韦荣球菌和产碱韦荣球菌是常见的二个种 。 口腔、咽部、胃肠道和女性生殖道的正常菌群，致病力不强，为条件致病菌。本属菌可产生内毒素，为脂多糖，有抗原性。,临床标本可采自软组织脓肿和血液。大多见于混合感染。临床分离率小于1。 小韦荣球菌可引起上呼吸道感染，而产碱韦荣球菌多见于肠道感染。,微生物特性,韦荣球菌形态相似，为G-球菌，排列成对或短链，近似奈瑟球菌。无鞭毛和芽胞。 专性厌氧，在血琼脂平板上发育良好，培养48h后，形成12mm圆形、凸起灰白色至黄色混浊菌落，不溶血。生化反应不活泼，不分解糖类，还原硝酸盐，触酶反应-+。 小韦荣球菌触酶试验阴性，而产碱韦荣球菌为阳性。,微生物检验,取临床标本作直接涂片、革兰染色、镜检。如发现-小球菌、成对或短链或不规则排列，疑为本菌属。可用厌氧血琼脂平板分离培养，23d观察结果，同时可接种硫乙醇酸盐肉汤或庖肉培养基，观察生长情况与形态，并做生化反应进行鉴定。,第四节-无芽胞厌氧杆菌,是一群不形成芽胞的厌氧杆菌，种类较多，包括类杆菌属、普雷沃菌属、紫单胞菌属和梭杆卤属等。是正常菌群，可作为条件致病菌引起内源性感染。,一、类杆菌属,是最重要的-无芽胞厌氧杆菌，其中以脆弱类杆菌最常见，是本属代表菌株，其DNA的G+C为39-48mol。,临床意义,类杆菌常寄生于口腔、肠道和女性生殖道，其中脆弱类杆菌占临床分离株的25，占类杆菌分离株的50，居临床厌氧菌分离株首位。肠道的重要菌群，为大肠埃希菌的1001000倍。 脆弱类杆菌能产生一种锌依赖金属蛋白酶或肠毒素，能使肠粘膜细胞产生病理效应。可引起女性生殖系统、胸腔及颅内感染。,微生物特性,-着色不均，培养物涂片呈明显多形性，无鞭毛、无芽胞，多数有荚膜。 专性厌氧，在厌氧血平板经2448h培养后，菌落圆形，表面光滑，边缘整齐，不溶血，加入氯化血红素、维生素K和20胆汁可促进生长。在胆汁七叶苷(BBE)培养基中生长旺盛，菌落较大，能分解胆汁七叶苷，使培养基变黑色，菌落周围有黑晕，故BBE可作为脆弱类杆菌的选择鉴别培养基。,触酶试验阳性，发酵葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，不发酵阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇和海藻糖，水解胆汁七叶苷，耐20胆汁，并生长旺盛。发酵代谢产物是乙酸、丙酸和琥珀酸，一般不产生丁酸：大部分菌株对青霉素G、卡那霉素和新霉素耐药，但95以上对氯霉素、氨苄青霉素、氧哌嗪青霉素、羧塞吩青霉素、亚胺硫霉素、甲硝唑等敏感。,微生物检验,标本发现-杆菌，染色不均，具有多形性，可疑为本菌，用BBE平板分离培养37厌氧培养2448h观察菌落特征。胆盐可促进生长。 根据发酵葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，水解七叶苷，耐20胆汁等生化试验作出鉴定。 气液相色谱检查其终末代谢产物，则有助于快速诊断。同时应注意与其他耐胆盐的类杆菌相鉴别。,二、普雷沃菌属,代表菌种是产黑色素普雷沃菌。 寄生在口腔、女性生殖道等部位的正常菌群，仅次于脆弱类杆菌。是一种常见的条件致病菌，可引起内源性感染和混合感染，女性生殖道及口腔感染较为多见。 其致病物质可能是胶原酶，与结缔组织的分解有关。,微生物特性,本群细菌的形态大同小异，涂片检查为G-球杆状，成双或短链，两端钝圆，有浓染和空泡。呈多形性。无鞭毛、芽胞和荚膜、 为专性厌氧菌。在厌氧平板上生长良好，经23d培养后，菌落为圆形凸起、呈-溶血。菌落初形成时为灰白色， 57d转为黑色。生长时需氯化血红素和维生素K，故在培养基中加入这两种物质可促进生长。,在20%胆汁培养基中绝大多数不生长，触酶阴性，除中间普雷沃菌、变黑普雷沃菌和部分洛氏普雷沃菌外脂酶均为阴性，脲酶阴性。多数对氨基青霉素、头孢菌素、卡那霉素和万古霉素耐药，而对甲硝唑霉素、利福平和新霉素敏感。,三、紫单胞菌属,与人类有关的有不解糖紫单胞菌、牙髓紫单胞菌和牙龈紫单胞菌等3种。代表菌种是不解糖紫单胞菌。其DNA的G+C为45-54mol。,主要分布于人类口腔、泌尿生殖道和肠道，在正常人体的检出率低。动物源性紫单胞菌在被动物咬伤感染的人体中检出，这些菌株与人源紫单胞菌相似，但基因型不同。主要引起人类牙周炎、牙髓炎、根尖周炎、也可引起肺胸膜炎、阑尾炎和细菌性阴道炎，尚可引起头、颈和下呼吸道感染。,(三)微生物特性(1),G-杆菌或球杆菌，两端钝圆，着色不均匀。维生素K和氯化血红素可促进本菌生长及黑色素的产生，冻溶血较非冻溶血更有利于早期产生黑色素。在厌氧血琼脂平板上，3537厌氧培养3-5d,形成1-2mm圆形凸起、边缘整齐、棕色或黑色菌落。用紫外线灯照射可出现红色荧光。,(三)微生物特性(2),产生色素，不分解或弱分解糖。触酶试验多阴性，胆汁七叶苷和脂酶试验阴性，吲哚多阳性。能液化明胶。代谢产物为乙酸、丙酸和异戊酸等。对卡那霉素、多粘菌素耐药，对万古霉素、头孢菌素、氯霉素、氯林可霉素、羟氨苄青霉素等均敏感。,（四）微生物检验,1标本采集 根据病变部位采取适当标本厌氧 送检：2本菌特征 G-杆菌或球杆菌，着色不均，在 厌氧血琼脂平板上形成的棕色菌落，用紫外 线照射可出现红色荧光。,（四）微生物检验,3与产黑色素普鲁沃菌相签别，产黑色素普鲁 沃菌可发酵葡萄糖、乳糖和蔗糖，而紫单胞 菌均不发酵糖。4与其他紫单胞菌相鉴别，不解糖紫单胞菌触 酶试验阴性，岩藻糖苷酶试验阳性；牙髓紫 单胞菌和牙龈紫单胞菌。岩藻糖苷酶试验均 为阴性，触酶试验阳性。,四、梭杆菌属,是临床常见的G-无芽胞厌氧菌，因其两端尖细如梭，故名梭杆菌。是人口腔、上呼吸道、肠道及泌尿生殖道的正常菌群，以牙缝中最为多见。在临床标本中，常见的有具核梭杆菌、坏死梭杆菌、死亡梭杆菌和溃疡梭杆菌等16种。其代表菌种为具核梭杆菌。DNA的G+C含量为26-34mol。,(一)临床意义,具核梭杆菌最常见，在口腔、生殖器、胃肠道和上呼吸道中被发现。 坏死梭杆菌是毒力很强的梭杆菌，可在儿童和青年人中引起扁桃体炎，有时并发单核细胞增多症，它是青年人扁桃体周围脓肿中最常分离到的厌氧菌。尚可引起脓胸和菌血症。,(二)微生物特性,1形态与染色 为典型的G-梭形杆菌，无鞭毛 不能运动。2培养特点 专性厌氧菌，在血平板上生长良 好。经48h培养后，菌落直径 l2mm，不规 则圆形略凸起，灰色发光透明，常显示珍珠 光斑点，通常不溶血。3. 不发酵任何糖类，吲哚和DNA酶试验阳性， 触酶阴性。不还原硝酸盐，在20胆汁中不 生长，脂酶试验阴性。主要代谢产物是丁酸。,(三)微生物检验,1标本采集 化脓感染者取脓汁，败血症 取血液并先增菌培养。2本菌特征 革兰阴性梭杆菌，两端尖细， 中间膨大、似梭状：绝大部分菌株在20 胆汁中不生长，不发酵葡萄糖，甘露醇， 不分解胆汁七叶苷，吲哚和DNA酶试验阳 性。,第五节 G+无芽胞厌氧杆菌,在厌氧菌中约占15。常见的有丙酸杆菌属、优杆菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属等四个属。,一、丙酸杆菌属,主要寄居于人皮肤皮脂腺、肠道以及乳制品中。临床有关的痤疮丙酸杆菌。 痤疮丙酸杆菌。是血液、腰穿及骨髓穿刺液培养时常见的污染菌。在植入修复物或器械引起的感染中也有重要作用，对心瓣膜损伤者可引起心内膜炎。与痤疮和酒渣鼻有关。,本菌特征 革兰阳性厌氧棒状杆菌，数次在厌氧环境下传代后可变为兼性厌氧菌，吐温-80可刺激其生长，大都能液化明胶，触酶试验阳性，发酵葡萄糖产生丙酸。,二、优杆菌,1.是人口腔与肠道正常菌群的组成成员，对机 体有营养、生物拮抗和维持肠道微生态学平 衡等功能。可造成混合感染，引起人体心内 膜炎等疾病。2.优杆菌呈多形性，20胆汁可促进生长，按 生化反应不同可分为水解糖优杆菌和不水解 糖优杆菌两大群，粘液优杆菌则可发酵葡萄 糖,迟钝优杆菌不发酵糖类。,三、双歧杆菌,1.是重要生理菌群。大肠中可达1081012g粪便，维持微生态平衡。能合成维生素，提高免疫力，抗肿瘤，起到营养保健作用。用于药品和食品的有青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌。,2.本菌有高度多形性，着色不均；菌落较小，圆形不透明；触酶试验阴性，发酵葡萄糖和乳糖。3.抵抗力弱，对杆菌肽、青霉素、红霉素、氯林可霉素等高度敏感。,四、乳杆菌,1.是消化道、阴道的正常共生菌，能分解阴道中的多种糖类而使阴道呈酸性，以抑制某些致病菌的生长。2.乳杆菌与龋齿的形成有密切的关系 .口腔的变异链球菌与消化链球菌使蔗糖变成葡聚糖，附于牙面形成齿斑。乳杆菌能溶解牙釉使之脱钙造成龋齿。,3. G+细长杆菌，菌落较小边缘不整齐；触酶、硝酸盐还原和吲哚等试验均阴性；发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖产生乳酸 。,第六节梭状芽胞杆菌属,G+，芽胞正圆形，直径大于菌体，位于菌体中央，极端或次极端，使菌体膨大呈梭状，故名梭菌属。 G+C值为2254mol，代表菌为酪酸梭菌。 在自然界分布广泛，多数为腐物寄生菌，有致病性主要有破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌与艰难梭菌。 引起人类疾病主要有破伤风、气性坏疽、食物中毒和假膜性结肠炎等。,一、破伤风梭菌,存在于自然界，在土壤和人与动物的肠道中都有存在。 当机体受创伤时或新生儿接生时使用不洁用具断脐带，破伤风梭菌可侵入伤口生长繁殖，分泌外毒素，引起机体强直性痉挛、抽搐，称为破伤风。 全世界每年约有100万病例发生，死亡率在20左右。,（1）致病因素,外毒素称为痉挛毒素。为蛋白质，不耐热，可被蛋白消化酶破坏，加03甲醛于毒素中37培养4周可转变为类毒素。 对中枢神经系统有亲和力，尤其是运动神经细胞，能与神经节苷脂结合。封闭了脊髓抑制性触突，阻止释放抑制性冲动介质，而破坏了正常的抑制性调节功能，从而发生肌肉痉挛性收缩 。,(2)临床意义,破伤风梭菌通过创伤感染，局部组织氧化还原电势降低。细菌繁殖且产生毒素。细菌不进入血流，引起严重毒血症，主要症状为骨骼肌痉挛。出现张口困难，牙关紧闭呈苦笑面容。肌肉发生强直性痉挛，呈角弓反张，呼吸困难，可因窒息死亡。引起的疾病叫破伤风 。,(3)微生物特性,1形态与染色 G+细长。有周鞭毛，无荚晚，芽胞正圆形，比菌体大，位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状。厌氧培养，细菌呈薄膜状扩散生长。2不发酵糖类，能液化明胶。产生H2S，形成吲哚，不还原硝酸盐，对蛋白质有微弱的消化作用。3根据鞭毛抗原不同，可分10个血清型。产生毒素的生物活性相同，可被任何型抗毒素中和。,（4）抵抗力,芽胞甚强，在土壤中数年不死，煮沸100 1h可被杀灭，能耐干热1501h，50gL的石炭酸1015h。 对青霉素、红霉素、四环素敏感，磺胺类有抑制作用，对氨基糖苷抗生素耐药。,(5)微生物检验,根据临床即可诊断，一般不作细菌学检查。1直接涂片 从病灶处取脓汁或坏死组织，直接涂片革兰染色，镜检观察菌体见一端有圆形芽胞呈鼓槌状的杆菌的形态，可初步报告结果。2厌氧培养 本菌较易分离。将可疑的材料接种庖肉培养基，在85水浴加热30min，杀灭杂菌，而芽胞得以存活，35-37培养2-4d。转种适宜的培养基，如新鲜血平板。厌氧培养18-24h，细菌呈薄膜状扩散生长。,3毒力试验,可确定毒素的有无及其性质。小白鼠尾根部皮下或肌肉注射01025ml培养滤液。阳性者，于注射后 12-24h，出现尾部僵直竖起、后腿强直或全身肌肉痉挛等症状，甚至死亡。 保护力试验是将025ml培养滤液混以l：10稀释的等量破伤风抗毒素，给小白鼠注射，如不发病，为阳性。,(6)检验结果分析与报告,一般取伤口分泌物涂片、染色，如见到典型的革兰阳性鼓槌样菌，即可报告：“检出破伤风棱菌”。 如取标本直接涂片、镜检，菌体形态不典型或菌甚少，难以判定时，则可进行分离培养、动物试验，如果试验结果阳性，则可报告：“经x天培养出破伤风梭菌”和“破伤风抗毒素试验阳性”。,二、产气荚膜梭菌,产气荚膜梭菌是气性坏疽的主要病原菌。 本菌可产生外毒素及多种侵袭性酶类，有12种。 这些毒素和酶与组织溶解、坏死、产气、水肿以及病变的迅速扩散蔓延和全身中毒症状均有密切关系。 此外，有些菌株还能产生肠毒素和溶血毒素、肠毒素能改变肠壁通透性，促使体液渗入肠腔，引起腹泻。,毒素，为卵磷脂酶，能分解人和动物细胞膜上磷脂和蛋白质的复合物，破坏细胞膜，引起溶血、组织坏死和血管内皮损伤，使血管通透性增高，造成水肿。还能促使血小板凝聚，导致血栓形成，局部组织缺血。 毒素引起人类坏死性肠炎。毒素有坏死和致死作用。,毒素有溶血和破坏白细胞作用，对心肌有毒性。毒素(胶原酶)能分解肌肉和皮下的胶原组织，使组织溶解。 毒素(透明质酸酶)能分解细胞间质中透明质酸毒素(DNA酶)能使细胞核DNA解聚，降低坏死组织的粘稠度。,(三)微生物特性,1为革兰阳性粗短大杆菌，两端钝圆，芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，在无糖培养基中有利于形成芽胞。在机体内可产生荚膜 无鞭毛，不能运动。,2培养特征,厌氧，繁殖迅速，培养2h后，在液体培养基深层即有明显生长；4-6h孵育后出现表面生长。在固体培养基上，经24h培养，菌落直径2-4mm，圆形凸起光滑、边缘整齐、无迁徙生长现象。在血平板上有溶血环，在蛋黄琼脂甲板上，菌落周围出现乳白色混浊圈。在庖肉培养基中产生气体，在牛乳培养基能分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，同时产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，并将液面的凡土林层向上推挤，甚至冲开管口棉塞，气势凶猛，称为“汹涌发酵”，是此菌的特征。,3生化反应,所有型菌株均能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖，产酸产气：不发酵甘露醇或水杨苷；液化明胶，产生H2S，不能消化已凝固的蛋白质和血清，吲哚阴性。主要代谢产物为乙酸和丁酸，有时也形成丁醇。,(四)微生物检验,1标本的采集 一般采取创伤深部的分泌物、 穿刺物、坏死组织块、血液、可疑食物。 2标本直接检查 可见到G+粗大杆菌，并有杂 菌，镜下白细胞较少形态不规则，是其特点， 对早期诊断具有定意义。不一定见到荚膜 和芽胞。,3分离培养本菌对低浓度氧有耐性，生长 迅速，故容易分离。在庖肉培养基中培 养8lOh后，转种