Thermo的离子阱和蛋白质组学ppt课件

蛋白质组学与生物质谱技术蛋白质组学与生物质谱技术主要内容主要内容蛋白质组学概念及主要研究内容蛋白质组学技术基础蛋白质组学面临的挑战及其对策蛋白质鉴定的主要策略及技术流程样品前处理色谱 /电泳分离质谱分析数据库检索Proteome and Proteomics一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质 (PROTEOME = PROTEin + genOME )Proteomics 通过研究蛋白质组揭示基因组序列和细胞行为之间的关系蛋白质组学是发现的科学，是系统生物学的重要组成部分蛋白质的鉴定是蛋白质组学研究的基本问题Proteomicsn: Proven Thermo SolutionsProtein IDQuantitationThroughputMSnPhosphorylationGlycosylationIntact Protein AnalysisProtein IsoformsBiomarkersDifferential ExpressionLabelsLabel-freeBottum-up and Top-down在蛋白质的水平上进行的蛋白质组学研究理想的蛋白质组学研究模式 , 当前技术攻关的热点技术上存在困难 , 近期难以实现通量化在多肽的水平上进行的蛋白质组学研究技术相对成熟 ,是当前蛋白质组学研究的主流信息不全蛋白质组学的基础和前提蛋白质组学的基础和前提双向电泳和多维液相色谱技术生物质谱技术基因组计划的完成生物信息学技术Promise of proteomicsRodriguez-Ortega et al. Nat Biotechnol. 2006 Feb;24(2):191-7. 蛋白质组的复杂性蛋白质组的复杂性 vs 蛋白质组学中的分离策略蛋白质组学中的分离策略2DE 在蛋白水平上的分离2DLC 在多肽水平上的分离Challenges in proteomicsLook deeper1 mL1 L1 L1,000 L 或 1 L 起始体积MS， 1 amol LOD血浆样品起始体积MS， 1 fmol LODAlbuminIgGtissue leaking proteinsInterleukinscytokinesFibronectin Complement C110-3/mili10-6/micromol/L10-9/nano10-12/pico10-15/femto10-18/atto 10-21/zepto10-24/yoctoInsulinPeptide drugs51065103ng/mL, average M.W. = 5 kDa5100510-3510-6510-9unknownsProtein drugs质谱质谱Science. 2006, Vol 312, 212-217离子源离子源EICIFABAPCIESIMALDIAPPIIon Transfer TubeESI Needle+/- 5 kVTaylor ConeSolvent evaporation and Ion desolvationESI: Electrospray ionizationMALDI： matrix assisted laser desorption ionization质量分析器质量分析器Single quadrupole 单四极杆Triple quadrupole 三级四极杆Ion trap 离子阱TOF 飞行时间OrbitrapFTICRQ-TOFTOF-TOFQ-trapIon trap-TOFLTQ-OrbitrapLTQ-FT裂解方式裂解方式CID/CAD 碰撞诱导裂解PSD 源后裂解SID/source fragmentation 源内裂解IRMPDECDETDPQDWhy trypsin?Trypsin的作用位点在 K、 R的 C-端肽键，专一性很强，水解蛋白产生的多肽（ tryptic peptide）多在 2-3 kDa，每个蛋白平均约产生 50个肽段左右。Tryptic Peptide在 ESI positive mode下离子化效率高质谱在此质量范围能够准确测量，加上较多的肽段数及很强的专一性，保证了 PMF策略鉴定蛋白质的可行性有效的 MS/MS图谱一般来自大小在 2-3 kDa 的多肽，且以 R、 K结尾的多肽裂解充分，有较强的规律性，保证了 MS/MS策略的可行性。PMF vs. MS/MS searchingPMF可以提供较高的序列覆盖率多采用 2DE-MALDI-MS配置，适用于简单样品没有序列信息，可靠性差已经过时MS/MS提供序列信息，可靠性高多采用 LC-ESI-MS/MS配置，适用于复杂样品存在采集时间限制问题广为接受Separation powerPeak capacities*measurements per hour2DE 500 - 10,000 protein spotsAffinity Chromatography 2Ion exchange Chromatography 10 protein levelGelfiltration 10Reversed Phase Chromatography 50Ion Exchange Chromatography 25Reversed Phase Chromatography 100 peptide level2DLC (IEX/RPC) 2,500Linear IT MSn 18,000 mph* Why 2D LC/MS?可鉴定具有极端 pI、疏水性、分子量的蛋白质适合膜蛋白重复性好容易自动化上样量大高灵敏度（溶液酶切）可根据样品灵活配置（但最后一维一般为 RP）Then why SCX/RP/MS?SCX和 RP的分离原理是互补的 SCX按荷电情况， PR按疏水性流动相是兼容的 pH3， ACN/water/salt SCX流动相中的盐可以在 RP时有效去除Tryptic peptides 在 SCX柱上可以有效保留Tryptic peptides在 SCX条件下是稳定的Copyright 2004 by the National Academy of SciencesBeausoleil, Sean A. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 12130-12135Fig. 1. Scheme for phosphopeptide enrichment by SCX chromatographyMS/MSMSGel Gel spot ProteolyticpeptidesMixture of Proteins DigestionProteolyticpeptidesDigestionLCProtein Identification WorkflowsPeak FindingPeak listSearch of a Sequence CollectionIdentified and ProteinsProtein CandidatesSignificance TestingProtein Function?Sequence Similarity Search样品的前处理样品的前处理 Very important process (VIP)!样品的损失吸附样品的污染角蛋白酶切不充分溶液酶切和胶内酶切How many peptides have we lost?The spectrum of fraction 108 after deletion of ACN by N2 flow.The spectrum of the ACN elute of the tube of fraction 108 after deletion of ACN by N2 flow.The spectrum of fraction 108 after deletion of ACN by N2 flow and ZipTip erichment.回收率和回收率和 操作步骤多少的关系操作步骤多少的关系Keep it simple!Total no. of stepsOverall % recovery 100 % recovery/step90 %80 %70 %60 %50 % MudPITMulti dimensional Protein Identification Technology在 Yates 发表关于 MudPIT 的文章的许多年前就有人发表关于 2D LC的文章。但是 Yates第一个将 2D LC用于蛋白质组学并引起学术界的广泛关注。此后，各种各样的类似 2D LC方法应运而生，其中有一些方法得到广泛接受和应用。2DLC2-dimensional liquid chromatographyMDLCMulti Dimensional Liquid ChromatographyRPCIEX RPC trapRPC trapon-line elution by salt plugs to trap columnIEXoff-line gradient elutionwith “classical”fraction collection RPC2D LC的三种配置形式的三种配置形式IEX RPCin-line MudPITMudPITSCX RPC优点构造简单SCX 和 RPC 填料在同一个柱子里自己装柱，成本较底缺点方法和柱子没有商业化SCX和 RPC都不在最佳状态必须得用挥发性缓冲体系由于需要很长的平衡时间，因而费时on-line 2D-LC优点全自动样品体积可根据后续 RPC调整在线脱盐、浓缩自由选择缓冲盐缺点SCX峰容量有限ACN浓度在 IEX和 RPC得一致两相分离都没