正交试验报告ppt课件

“救命仙草 “石斛ShihuDENDROBII CAULIS石斛简介我石斛属兰科石斛属多年生草本植物，全世界约有 1400 种，其中铁皮石斛(Dendrobium candidumWal.l exLind.l )是我国常见的石斛品种之一。铁皮石斛具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖和降血脂等多种功效，现代药理学研究表明， 石斛多糖是石斛中的主要功能成分 。 产地： 主产于广西、贵州、广东、云南、四川等省区。制剂开发目前市场上已研制开发出了铁皮枫斗、铁皮石斛 冲剂 （颗粒）、铁皮石斛 饮料 、铁皮石斛微粉、铁皮石斛 酒 、铁皮石斛 茶 、复方天人百合铁皮石斛 、复方鲜石斛 胶囊 、复方鲜 石斛片 、复方鲜 石斛丸 、纳米石斛明目制剂 药物 、鲜石斛晶、纳米石斛夜光制剂药物、铁皮石斛复方制剂等系列 保健产品 。更多的产品有待于进一步的研究与开发。前景分析从目前的市场看， 特级纯正铁皮枫斗 价格在 每公斤十万元左右 。一级枫斗价格在 每公斤二到三万元 ，且有价无货，其产量只有需求量的 0.004% ，可谓一克难求。预计在 10年内铁皮石斛的产量仍难以满足市场的需求。 （供不应求）据全国中资源普察统计，目前，整个 石斛市场 年需求总量在 8000 10000吨，且以每年 10% 15%的需求递增。而人工种植刚刚起步，再加上其产品的开发商家逐年增加，导致几乎已无法获取到其成品进行加工，所以许多企业处于半停产或待料生产状态。国内石斛研究热点分析 铁皮石斛原球茎 多糖 提取最佳工艺研究 超声法提取铁皮石斛 多糖 工艺的研究 正交试验优选铁皮石斛类原球茎 多糖 的提取纯化工艺 石斛中石斛 多糖 的提取工艺研究 棒节石斛中的 多糖 分布及提取工艺研究 超声波辅助提取金钗石斛 多糖工艺优化 研究 基于正交试验法的铁皮石斛原球茎生长和 多糖合成研究 闪式提取铁皮石斛 多糖热 点分析（一）石斛多糖提取工艺 稀土微肥对铁皮石斛试管苗壮苗的影响 铁皮石斛 原球茎 液体悬浮 培养 的研究 霍山石斛 原球茎 液体 培养 条件的优化 大苞鞘石斛胚组织 培养 及植株再生研究 金钗石斛类 原球茎 诱导及增殖的正交试验 3种石斛兰以 茎段 为外植体的 离体快繁技术 霍山石斛细胞悬浮 培养 及条件优化 春石斛 离体培养 条件优化及其试管开花研究 金属离子对霍山石斛类 原球茎增殖 及植株再生 的影响 不同激素浓度对铁皮石斛高效 快繁体系 的影响 正交试验优选环草石斛 不同氮磷钾营养水平对铁皮石斛 组培苗 生长的影响 大苞鞘石斛 组织培养 快繁研究 不同因素对大苞鞘石斛 原球茎分化 的影响 金钗石斛 原生质体 的制备与融合 铁皮石斛组培苗生根条件优化研究 石斛 ISSR-PCR体系的优化 春石斛和铁皮石斛试管苗 壮苗生根 条件的优化 石斛明目胶囊药材水煎醇沉工艺的正交试验热 点分析（二）石斛快繁技术石斛多糖提取工艺优化石斛多糖含量的市场调查赵立，阚 (kn)永军，庞文生等按照 2015 版中国药典铁皮石斛项下 多糖及甘露糖含量 测定方法，随机检测了目前市售铁皮石斛的质量，结果显示不同产地铁皮石斛 多糖含量 在 34% 42% 之间，甘露糖含量在 19% 27% 之间。市售铁皮石斛含量差别较大，这可能与其 品种、产地、采收期及种植年限 有关，但其含量均符合药典规定范围 ( 总多糖含量不低于 25%，甘露糖含量在 13% 37% 之间 ) ，可作为铁皮石斛药材入药。 赵立等 . (2017). 市售铁皮石斛多糖及甘露糖含量比较研究 . 海峡药学 , 29(7), 29-31. 李彩霞 , & 竹剑平 . (2010). 不同采收期铁皮石斛中多糖含量比较 . 药物分析杂志 (6), 1138-1139.多糖质量分数考查指标及方法 多糖得率 =提取得到的多糖质量 /原料质量 100% 多糖含量：多糖含量 = 总糖 - 还原糖。石斛多糖含量的测定方法： 苯酚硫酸法苯酚制取 :取苯酚 200g，加铝片 O.2g和碳酸氢钠 O.1g，蒸馏，收集 182摄氏度馏分，称取一定量重蒸苯酚，加入蒸馏水混匀，溶解即得。置棕色瓶中，放冰箱内备用。不同提取方法对石斛多糖含量测定的影响方法：分别采用 回流提取 、 改进回流提取 、 超声波提取 与 超声辅助热回流提取法 对石斛多糖进行提取，通过苯酚 - 硫酸法检测其多糖含量。结果： 4种提取方法所测得的多糖含量分别为（ 13.4730.634）、（ 15.6920.743）、（ 11.870.536）、（ 16.290.407）。结论：采用 超声辅助热回流提取法 所得含量最高，而且提取时间短、提取较为彻底，该 方法比较技术先进，提取效率较高，优于水提法，提取过程中能量消耗大，成本相对较高。 罗傲雪 , 范益军 , 罗傲霜 . (2010). 不同提取方法对石斛多糖含量测定的影响 . 中国药房 , 21(7), 601-602.多糖工艺流程 热水法回流提取多糖工艺流程：原料 称重 回流去杂质 热水浸提 过滤 滤液浓缩 80 乙醇（ 4 5倍）沉淀 过滤 烘干 复溶 Sevage 法除蛋白（多糖粗品的纯化过程） 醇沉 烘干 铁皮石斛类原球茎多糖。影响因素：加水量、水温、浸提时间、提取次数优缺点： 是传统的多糖的提取方法，成本低，取材方便，提取条件易于控制，经济适用，操作方法相对简单但是繁杂，重复提取次数较多，提取时间过长，提取效率相对较低。试验材料和仪器试验材料 悬浮培养于 1/2MS液体培养基的铁皮石解原球茎 ， 于 60度烘干后，经粉碎、干燥恒重处理后备用。试剂 氯仿、苯酚、浓硫酸、正丁醇、乙醇、葡萄糖、冰醋酸、胃蛋白酶、考马斯亮蓝 G-250、牛血清蛋白均为 分析纯 。仪器 UV-1700型分光 光度计 、索氏 提取器 、 HH-S恒温水浴涡 、 ZFQ85A旋转 蒸发仪 、 SHZ-200型双配套循环水式多用 真空泵 、 冷冻干燥机 。采用 L8(24)正交设计，试验重复 2次，各处理内容见表 1。多糖提取条件的确立 何铁光 , 杨丽涛 , 李扬瑞等 . (2006). 铁皮石斛原球茎多糖提取最佳工艺研究 . 西北农业学报 , 15(5), 240-243.次数较少时间 提取次数 温度 加水量整体含量小结果分析：影响响大小顺序是 :提取次数 溶剂用量 提取温度 提取时间，各因素的最佳水平为 A1B2C1D2。2h4h1次3次8010010倍20倍根据多糖性能，选用水煎煮工艺，选择提取时的 加水量、提取时间、提取次数、药材粉碎度 4个试验因素，每个因素 3个水平进行优选 ,采用 L9(34)表对石斛进行石斛多糖的提取和测定，并作为考察指标。因素水平表见表 1。钱叶 , & 吕不望 . (2005). 石斛中石斛多糖的提取工艺研究 . 中国现代应用药学 , 22(4), 293-294.结果分析： 影响石斛多糖含量的因素依次为粉碎度 提取次数 加水量 提取时间。最佳提取条件为 A1B3C3D3,但根据计算， A因素 2， 3水平间几乎在同一数量级， 从省时节能 ，降低成本的角度考虑，选择 A2B1C2D3， 即石斛中石斛多糖的最佳提取条件为将药材粉碎至粗粉，加水 20倍量 ,提取 3次 ,每次 4h。4h6h8h10倍20倍30倍2次3次4次饮片小段粗粉多糖粗品的纯化原理：石斛多糖粗品中含有蛋白质 ,为进一步纯化多糖粗品需经脱蛋白处理。常用Sevage法即将多糖粗品的水溶液与氯仿和正丁醇混合 ,使蛋白质变性成为不溶性聚集在氯仿和水的界面上 ,经离心后可将蛋白质去除。粗多糖脱蛋白时 ,样品 /氯仿 +正丁醇 (v/v)为1B0.35,氯仿 /正丁醇 (v/v)为 1B0.4,反应时间以 5 min最佳。Sevage法脱蛋白的正交试验：除去蛋白质采用 Sevage方法，按 L4(23)正交设计 ,试验重复 2次。另外 ,采用蛋白酶法 Sevage法交替数次脱蛋白。以样品溶液与 Sevage试剂体积比（ A）、氯仿与正丁醇体积比（ B）、反应时间（ C）为考察因素。粗多糖脱蛋白时 ,样品 /氯仿 +正丁