生物样品前处理方法

生物样品前处理方法content生物样品处理目的前处理过程及方法分析方法的限度要求生物样品的种类置含有 抗凝剂 的试管中，2500 3000rpm离心 510min，淡黄色上清液，约为全血的 50-60%药物动力学，生物利用度，临床治疗药物浓度监测置试管中，于 37 或室温放置 30min 1h，血液 凝固后，剥去试管壁上的血饼， 2500 3000rpm离心 5 10min，淡黄色液体，约为全血 20-40%血清的获取量小，但血清成分更 接近于组织液的化学成分 ，测定血清中有关物质的含量，比全血更能反映机体的具体情况加入 抗凝剂 混合，防止凝血后影响测定对于 与红细胞结合 的药物，以及血浆浓度低或药物在血浆与红细胞分配比不恒定的情况下应用一 . 生物样品的种类一般采集时间尿（规定时间内采集尿液体积和排入尿中的药物总量） 药物浓度高，但变化 体内药物清除 以原形、 I相及II相代谢物等多种形式通过尿液排出排出预测药物代谢过程、类型 ,计算药物尿清除率、生物利用度的研究。在漱口后 15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样，石蜡片，聚四氟乙烯块，纱布球，柠檬酸，维生素 C等置于舌尖，弃取初始部分后采集血浆游离药物浓度（ P）密切相关，可使用 唾液样品 CS/CP比值较恒定时 ，可代替血样进行TDM及药代动力学研究头发组织：脑、心、肝、脾、肺、肾、胃等目的目的去除生物样品中的大分子杂质，满足测定方法对分析样品的要求保护仪器性能，改善分析条件分离并富集所要测定的成分药物从缀合物及结合物中释放测定药物的总浓度 二 .生物样品处理的目的蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质内源性酸内源性酸内源性酸药药药药 药加入强酸 超滤法加入中性盐 加热法酶水解法 溶剂解法加入重金属盐 三 .前处理过程及方法1.1-溶剂解法原理 ：使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生 变 化而使 蛋白质凝聚 。 常用有机溶剂 ：乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃 试剂用量 ：溶剂体积 与 血样比为 1 3 1操作 ：有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合 后 离心分离 ，取上清液作为样品。注意 采用 超速离心 （ 12000rpm）分离 1 2min1.2 加入中性盐原理 ：中性盐使蛋白质脱水而沉淀 常用中性盐 ：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐 及 枸橼酸盐等 试剂用量 ： 饱和 硫酸铵 与 血清比例为 2 1 操作 ：血清与中性盐按一定比例混合后超速离心 （ 10000rpm）分离 1 2min，取上清液 作为样品 。上清液 pH 7.0 7.7。1.3 加入强酸原理 ：强酸与蛋白质形成不溶性盐而沉淀。 常用 ： 10三氯醋酸、 6高氯酸、 5偏磷酸等。 操作 ：血清与强酸的比例为 1： 0.6混合，离心（ 10000rpm） 1 2min，即可。 上清液 pH 0 4，不适于酸性下分解的药物 。过量酸的排除 ：过量三氯醋酸可通过煮沸或乙醚 提取 除去；高氯酸、偏磷酸等可用碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中和后加乙醇使产生高氯酸钾（钠）沉淀被除去。 1.4 酶水解法测定一些 酸不稳定及蛋白结合牢 的药物枯草菌溶素 ：使组织溶解，使药物析出。一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的 pH活圈（ PH7.0 11.0）内使蛋白质的肽键降解，在 50 60 具有最大活力。 优点 ：可避兔某些药物在酸及高温下降解，对与蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英纳），可显著改善回收率；可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象。不适用 于在碱性下易水解的药物 。1.5 超滤法性质 ：以 多孔性半透膜 （超滤膜）作为分离介质的一种膜分离技术。 特点 ：无需加热；无需添加化学试剂；无相变化；无破坏性；样品量少；简便快捷，结果稳定可靠 应用 ：游离药物首选方法，尤其适合 TDM 操作 ：分子量截留值在 5万左右的超滤膜过滤可将分子量大的血浆蛋白以及结合了药物的血浆蛋白分离。尿中和有些血中的药物葡萄糖醛酸硫酸2、缀合物的水解由于 缀合物较原型药物具有较大的极性 ，不易被有机溶剂提取，所以：酸水解 可加入适量的盐酸液。酶水解 对于遇酸及受热不稳定的药物，常用葡萄糖醛酸苷酶 、 硫酸酯酶 或两者的混合酶3.分离、纯化和浓集3-1. 液 -液萃取法 LLE乳化现象 ：加固体 NaCl；离心；低温冰箱中快速冻凝对于 极性大 的药物：离子对提取法；提取烷基化法有机溶剂 (1、 2)生物样品 （ 水溶 ） (1)药物 内源性杂质溶解度、沸点低、无毒、与水不溶：乙酸乙酯、乙醚（ 1.2%水）碱性药物于碱性；酸性药物于酸性。酸性 ；水溶性碱性；亲脂性的3-2. 固相萃取法 SPE原理 ：不同填料作固定相的微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质后，再用适当溶剂洗脱药物。亲脂型 大孔吸附树脂，亲脂型键和硅胶规格 亲水型 硅胶，硅藻土，棉纤维离子交换型3-2. 固相萃取法 SPE泵甲醇1. 柱预处理2. 进样3. 净化4. 洗脱水 样品 弱溶剂强溶剂固相提取步骤示意图：被测组分的浓集 真空蒸发或抽真空挥发 直接通入气流使溶剂挥发抽真空 氮气或空气分子中含有 活泼氢者（ R-COOH、 R-OH、 R-NH2、 R-NH-R)极性大检测器不够灵敏挥发性低对热不稳定增加药物稳定性改变药物的极性和挥发性，改善被测组分的色谱行为提高对光学异构体分离的能力 化学衍生化4.化学衍生化GC衍生化反应类型：烷基化 ； 酰化 ； 硅烷化 活泼氢被烷基 、 酰 基、 硅烷 基 取代光谱GC、 HPLC色谱分析HPLC-化学衍生化方法柱前衍生法柱后衍生法荧光衍生化反应电化学衍生化反应非手性衍生化反应HPLC-化学衍生化发生衍生化反应前后反应特征点击添加标题 紫外衍生化反应先进的处理技术1. 固相微萃取 SPME基于待测物质在样品和萃取涂层中的平衡分配的过程。相似相溶原理材料：聚二甲基硅氧烷聚丙烯酸酯SPME 与 GC 及 HPLC联用2. 柱切换技术 是一种 在线的固相分离技术切换阀3. 微透析技术MD是一种膜分离技术，利用膜透析原理，对细胞液进行流动性连续采样，在不破坏生物体内环境的情况下，直