第七章发酵工业制药part3

六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用主要应用：1. 提高次级代谢产物的产量 2. 改进代谢产物的组分 3. 改进菌种的生理性能4. 产生新的代谢产物 提高次级代谢产物的产量基因工程技术提高抗生素产量的主要手段n 增加限速酶的基因拷贝数n 增加正调节基因，去除负调节基因n 增加抗性基因的拷贝数六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用1.增加限速酶的基因拷贝数原理：A B C D E （代谢产物） Ea Eb Ec Ed限速酶Rate-limiting Bottleneck例 1：起始原料 ACV三肽 异青霉素 N 青霉素 Ea Eb Ec-aminoadipic acidL-cvstcinc Ea： ACV合成酶 Ec：异青霉素 N酰基水解酶L-valinc Eb：异青霉素 N合成酶 青霉素酰基转移酶六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用异青霉素 N合成酶对 P.chrysogenum 青霉素产量的影响菌株 原始菌株 低产菌株Wis 54-1255高产菌株AS-P-78IPNS的基因拷贝数1 - 9-14mRNA 1 - 32-64青霉素产量 100%导入带 IPNS的基因片段140%六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加 IPNS基因提高青霉素产量六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用例 2. 头孢菌素 C的生物合成的限速酶在头孢菌素 C的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素 C外，在发酵液中还积累另一种产物 -青霉素 N。问题：积累中间产物 -青霉素 N原因：下一步反应为限速酶反应解决：导入额外的扩环酶 /羟化酶基因结束：使头孢菌素 C的产量提高 25-50%，积累的青霉素 N消失。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加限速酶基因提高头孢菌素 C的产量六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加限速酶的其它例子 -3：例 3.十一烷基灵菌红素 产生菌：天蓝色链霉菌 S.colocolor A 3(2)acetyl CoA 构建重组质粒（带甲氧基转移酶）Polyketide pathway转化到氧甲基转移酶缺陷变株转化菌株十一烷基灵菌红素产量提高 5倍S-酰苷甲酰氨酸氧甲基转移酶六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加限速酶的其它例子 -4：例 4. 泰洛星 （ Tylosin） 产生菌：氟式链霉菌 （ S.fradiae）acetyl CoA + malony CoA Polyketide pathway构建重组质粒（带 甲氧基转移酶 ）转化到氟式链霉素（ S.fradiae ）泰洛星（ Tylosin）产量显著提高甲氧基转移酶大菌素（ macrocin）Tylosin转化菌株六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用2.增加正调节基因，去除负调节基因调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正调节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因的转录。将带有正调节基因片段的重组质粒转化到生产菌株中，由于转录功能的增强，使生物合成结构基因得以高水平的表达，提高了代谢产物的产量。反之，对于负调节基因，通过基因工程的手段，将其祛除或失活，就能解除阻扼作用，同样导致使生物合成结构基因高水平的表达，提高代谢产物的产量。 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用次级代谢产物生物合成基因簇内的正负调节基因基因 效应 菌株 次级代谢物 功能brpA 正 吸水链霉素 Bioalaphos 激活 bar（ Bialaphos 抗性基因和 6个 bap（生物合成）基因的转录ty1G 正 弗式链霉菌 泰洛星 激活 tyl F（编码 MOMT）和其它 tyl生物合成基因的表达actII 正 天蓝色链霉菌 放线紫红素 能使 act菌株放线紫红素的产量增加 3040倍mmy 负 天蓝色链霉菌 次甲霉素 该基因的插入失活导致次甲霉素过量生产strR 正 灰色链霉菌 链霉素 调节链霉素的生物合成调节基因在次级代谢产物合成中的作用调节基因在次级代谢产物合成中的作用六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用去除负调节基因时结构基因超量表达Methylenomycin （次甲霉素）次甲霉素是由天蓝色链霉菌产生的抗生素，研究结果表明，次甲霉素是由天蓝色链霉菌携带的质粒 SCPI编码的。在其生物合成结构基因的上游，存在一个负调节基因 -mmy克隆到质粒上转化变青链霉菌转化子（次甲霉素高产表达）六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用2.增加抗性基因的拷贝数抗性基因的作用是避免抗生素产生菌被自身的代谢产物所杀灭。其作用可通过三条途径实现： 1. 抗性基因产物（酶）将抗生素作用的底物加以修饰； 2将抗生素的分子结构加以修饰，使其失活； 3将抗生素分子排出细胞外。提高菌种耐受自身产生抗生素的能力是取得高产的前提，此外，将胞内的抗生素排出胞外，还可以解除高浓度代谢产物对其生物合成的反馈调节，使产物大量合成。将抗生素抗性基因片段连接到适当的质粒上，用得到的重组质粒转化抗生素生产菌株，就可能使抗生素的产量得以提高。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量例 1. Davies J. 利用链霉菌质粒 pIJ702 从卡拉霉素产生菌克隆了 6-N-氨基糖苷乙酰转移酶 AAC6的基因（ aacA），该基因产物在乙酰辅酶 A的存在下，可将氨基糖苷类抗生素的氨基糖 6乙酰化。将 aacA基因转入新霉素和卡那霉素的产生菌中，结果显著提高了抗生素的产量。六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用卡拉霉素 6-乙酰转移酶 AAC(6)的作用六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量 -2螺旋霉素抗性基因 srmB例 2.重组质粒转化 S. ambofaciens（生二素链霉菌）转化子 使螺旋霉素产量提高六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 改进代谢产物的组分链霉菌产生的次级代谢产物常常是一组结构相似的混合物。每个化合物称它为它的一个组分。多组分产生的分子基础是因为次级代谢产物的合成酶对底物的选择性不强以及合成途径中分支途径的存在。通过基因工程手段，灭活某分支途径的酶，就可以去除该分支途径的产物。此策略常用来去除发酵产物中的无用组分，提高有用组分的含量。 六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用例一： 阿维菌素产生菌的基因改造六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用阿维菌素 “B”组分转化成 “A”组分的分子基础六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用阿维菌素 C5位的甲基化六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用阿维菌素生物合成基因簇六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用1. 用基因工程手段灭活 C5-氧甲基转移酶基因主要过程：1. 克隆阿维菌素生物合成的 aveD基因2. 构建 gene disruption 质粒3. 转化阿维菌素产生菌（ S.avermitilis）4. 挑选双交换菌株5. 阳性菌株的发酵6. 发酵产物的组分分子（ HPLC，质谱）六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用Disruption plasmid of aveD gene六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用双交换菌株（阻断变株）的挑选六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用发酵产物的 HPLC分析六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用D24-1组分的质谱分析六、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用2. 只产生 Avermectin “2” 组分基因工