第十章重组dna的构建、筛选及鉴定分析

第十章 重组 DNA的构建、筛选及鉴定分析1. 重组 DNA导入宿主细胞2. 重组子的筛选3. 阳性重组子的验证与分析一一 目的基因的获取目的基因的获取5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3 Poly(A) RNA5 T12MN 3锚定引物 逆转录5MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33 M N TTTTTTTTTTTT 5变性5MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33 M N TTTTTTTTTTTT 5退火5 T12MN 3锚定引物寡核苷酸随机引物3 M N TTTTTTTTTTTT 5延长dNTP、 Taq聚合酶3 M N TTTTTTTTTTTT 55 MNAAAAAAAAAAA 3变性、退火、延伸电泳显示T12MN(M为 A、 G、 C， N为 A、 T、 G、 C) 启动 cDNA第一链合成不同长度的PCR产物回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对随机结合到cDNA链上mRNA差别显示技术o 在寻找新基因工作中起到积极的作用o 发育机理研究o 杂种优势机理研究二 重组 DNA的构建重组 DNA 的概念将目的基因（外源 DNA 分子）用 DNA 连接酶在体外连接到适当的载体上，即 DNA 分子的体外重组，这种重新组合的 DNA 称为重组 DNA 重组 DNA的构建方法1 平末端分子的连接 连接效率还是很低； 连接常常破坏原有的限制性核酸内切酶 识别序列 ，可能改变原有 DNA 的读码顺序； 由于平末端分子两个末端都是平的，因而在连接反应中外源 DNA 分子在载体中的插人方向有 正反两种 可能，增加了 假阳性 ； 由于都是平末端分子，可能出现多个平末端分子串联后再插人到载体中的多片段 “叠连 ”现象 ，增加了假阳性的概率 人工改造实现平末端分子转化为粘性末端分子 2 粘性末端分子的连接 相同的粘性末端，在进行连接时，这两个 DNA 片段在 DNA 连接酶作用下就可以共价地连接起来，形成重组 DNA 三三 重组重组 DNA分子导入受体菌分子导入受体菌转化是 感受态 的大肠杆菌细胞捕获和表达 DNA 分子的基因转化方法 转导是指通过 噬菌体 将一个宿主的 DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象 显微注射技术是一种利用显微注射仪，通过机械方法把外源 DNA 直接注人细胞质或细胞核的基因转化方法 电转化法也称为电穿孔法在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，结果在质膜上形成纳米大小的微孔， DNA 能直接通过这些微孔，或者在膜孔自行修复闭合时伴随膜组分的重新分布而进人细胞质中 基因枪法，又称微弹轰击法是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进人细胞内的现象，将包裹在金属颗粒表面的 外源 DNA 分子随之带人细胞进行表达的基因转化方法。 宿主细胞 原核生物细胞 大肠杆菌 枯草杆菌真菌细胞 酵母菌细胞植物细胞 动物细胞 转化的目的 o 一是大量产生重组 DNA 在完成连接反应后，重组 DNA 往往只有纳克级的量，不易操作和进一步分析 p 二是对重组 DNA 进行纯化。在构建重组 DNA 过程中很难保证体系中不污染其他的 DNA 分子 第二节 重组子的筛选一、遗传表型筛选法遗传表型筛选法 o 利用抗药性基因的筛选方法 o b一半乳糖昔酶显色互补筛 利用抗药性基因的筛选方法 o 抗性标记直接筛选法 载体 DNA 上携带有宿主细胞敏感的抗生素的抗性基因，pBR322 质粒载体，它上面含有的氨卞青霉素抗性基因和四环素抗性基因 抗性基因插入失活筛选法 当用某种限制性核酸内切酶消化并在此位点插入外源目的 DNA 时，抗药性基因不再被表达，称为基因插入失活。因此，当此插人外源 DNA 的重组质粒载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时，根据对该药物由抗性转变为敏感这一特征，观察菌落生长状况便可筛选出阳性重组子 质粒载体抗性标记筛选o 利用抗药性基因的筛选方法 o b一半乳糖苷酶 显色互补筛选蓝 -白筛选-半乳糖苷酶可被安慰诱导物 IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与 乳糖结构类似 但不能被 -半乳糖苷酶 降解）诱导的启动子调控之下 -半乳糖苷酶能把培养基中无色的 X-gal（ 5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -D-半乳糖苷）底物分解成 半乳糖 和 深蓝色的 5-溴-4-氯 -靛蓝 营养缺陷互补 o 营养缺陷型是指某菌株经突变后，丧失了合成某营养素(氨基酸，维生素，核酸等 )的功能，若在培养基上培养必须添加相应的营养素才能生长 o 如果外源基因能够实现其功能的表达 ,重组 DNA 转化到大肠杆菌宿主细胞之后，则它所表现出来的表型性状即可作为重组子筛选的标记 o 当外源目的基因为合成 亮氨酸 的基因时，将该基因重组后转人缺少 亮氨酸合成酶基因 的菌株中，在仅仅缺少亮氨酸的基本培养基上筛选，只有能利用表达产物亮氨酸的细菌才能生长，因此，获得的转化子都是重组子 二、快速裂解菌落鉴定重组 DNA分子 o DNA 分子由于 外源目的基因片段 插人到 质粒载体 上，所以 重组质粒的相对分子量 一定比 非重组质粒 要大 核酸分子杂交检测法 其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸（ DNA 或 RNA ）单链，在一定的复性条件下，可按碱基互补原则退火形成双链 分子杂交方法可分为固相液相杂交、液相分子杂交和原位杂交 固相液相杂交，亦称膜上印迹杂交 o 提取重物重组质粒 DNA o 琼脂糖凝胶电泳分离 o 碱变性液浸饱 o 中和液漂洗 o 进行 DNA 印迹转移 o 80 下烘烤 1 h 或短波紫外线交联法固定 DNA o 与放射性同位素标记探针杂交 o 放射自显影后确定阳性重组子 southern 印迹杂交 Northern 印迹杂交 该法主要针对 RNA 分子的检测 由于 RNA 分子与硝酸纤维素膜结合能力相对较差 一是防止单链 RNA 形成高级结构，故必须采用变性凝胶电泳；二是电泳过程中始终要有效抑制 RNase 的作用 直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜