第七章酶通论

第 七 章 酶通论主讲人： 罗云敬内容提要 绪论 酶催化作用的特点 酶的化学本质 酶的命名和分类 酶的专一性 酶的活力测定和分离纯化 核酶 抗体酶 酶工程简介酶学研究简史酶 (enzyme)希腊语原意 : in yeast，生物体内催化化学反应的物质，细胞中的球蛋白多数为酶。1783年 Spallamzan 发现鸟的胃液能消化肉。1814年 Kirchhoff发现稀酸对淀粉的加水分解作用。并发现麦芽抽提液加入淀粉后能生成麦芽糖 , 即麦芽抽提液中必定有能水解淀粉的水溶性物质 ferment (酵素 )。1830年 Kuhle开始使用 Enzyme这一术语。1833年 Payen & Persoz 从麦芽抽提液得到了 ferment, 称 diastase, 即现在的 amylase。1835年 Berzelius提出 ferment起的是催化作用。绪论1857年 Pasteur认为发酵分几个阶段进行 , 每一步都有特定的酶参与 , 但酶只在活体细胞中才能起作用。1894年 Bertrand发现了水解酶以外的酶。1897年 Buchner兄弟以 “没有酵母的酒精发酵 ” 证明了酶可以离开细胞起作用。1910年 Halden & Young 发现酶是蛋白质与耐热性低分子量化合物(cofactor)的复合物 , 提出蛋白质只是担体。1913年 米氏方程建立。1926年 Sumner得到了 Urease的结晶，随后 , Northrop结晶化了 Pepsin, Trypsin等蛋白酶，结晶中测定不到 cofactor。1929年 Warburg发现呼吸链诸酶中的血红素。 1936年 微生素与辅酶关系的阐明1959年 Sutherland发现 cAMP与酶和激素的关系。1970年 Restriction enzyme的发现 基因工程 。一 .酶催化作用的特点(一 )酶和一般催化剂的比较加快反应的速度 ,但不改变反应的平衡常数。酶本身在反应后也不发生变化 .（二）酶作为生物催化剂的特点1.易失活2.具有很高的催化效率3.具有很高的专一性4.酶的活性受到调节控制(1)调节酶的浓度(2)通过激素调节酶的活性(3)反馈抑制调节酶的活性(4)抑制剂和激活剂调节酶的活性(5)其他调节方式如别构调节亲环素乳清苷酸碳酸酐酶磷酸丙糖异构酶 磷酸葡萄糖异构酶羧肽酶脲酶全酶 (holoenzyme)|酶蛋白（ apoenzyme)+辅助因子 （ cofactor)cofactor二 .酶的化学本质及其组成(一 )酶的化学本质 :大多数酶是蛋白质(二 )酶的化学组成 辅基， prosthetic group辅酶， co-enzyme金属离子金属例子作为一些酶的辅因子己糖激酶等过氧化氢酶等丙酮酸激酶细胞色素氧化酶精氨酸酶等固氮酶脲酶谷胱甘肽过氧化物酶碳酸酐酶 乙醇脱氢酶生物胞素 生物素辅酶 A泛酸黄素腺嘌呤二核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 烟酸吡哆醛磷酸四氢叶酸 叶酸酯焦磷酸硫胺素三 .酶的命名法（一）习惯命名法（二）国际系统命名法（三）国际系统分类法及酶的编号每种酶地编号由 4个数字组成，中间用 “ .” 隔开，分别代表大类 .亚类 .亚亚类 .序号，如： EC1.2.3.2是黄嘌啉：氧氧化还原酶的编号。EC号的第一个数字1. oxidoreductase 氧化还原酶类2. transferase 转移酶类3. hydrolase 水解酶类4. lyase 裂合酶类5. isomerase 异构酶类6. ligase/synthetase 连接酶类氧化还原酶氧化还原酶转移酶转移酶水解酶水解酶裂合酶裂合酶异构酶异构酶连接酶连接酶四 .酶的专 性(一 ) 酶的专一性 1.结构专一性2.立体异构专一性(二 ) 关于酶作用专一性的假说锁和钥匙假说；诱导契合假说 ；过渡态互补学说。五 .酶的活力测定和分离纯化(一 ) 酶活力的测定1.酶活力酶不易制成纯品，其中含有很多杂质，所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。酶活力 是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即 测定酶促反应的速率 来获得的。一般情况下，产物和底物的改变量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，这是由于反应体系中使用的底物往往是过量的，而反应时间通常又很短，尤其是在酶活力很低时，底物减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易准确；反之，产物从无到有 (如不纯的酶制剂中内源性产物不计的话 )，只要测定方法灵敏，准确度可以很高，故酶活力测定绝大多数是采用 测定产物生成速率 的方法。2.酶的活力单位酶活力的大小是以酶单位数表示的。所谓 酶单位是在某一特定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量 ，而速度即指单位时间 (秒、分、小时 )内反应物的变化量 (毫克、微克、微摩尔等 )。酶单位一般有三种表示方法。 （ 1）惯用单位 :60年代前，各种酶活力的表示法或酶单位的定义没有统一的标准，不同酶、 甚至同一种酶不同的测定法可有不同的定义。如谷丙转氨酶的改良穆氏法、金氏法和赖氏法的定义以及磷酸酶的布氏法、金 -阿二氏法和皮 -劳二氏法的定义均不相同，因此正常范围也相差很大，容易造成混乱，有时甚至直接用测得的物理量，如单位时间的吸光度变化 ( A/ t)来表示酶单位。（ 2）国际单位 :1961年国际生化学会 (IUB)酶学委员会建议使用统一的国际单位 (IU)。规定一 个国际单位(IU)为 在实验规定的条件下 (如温度为 25 、最适pH、最适底物浓度时 )，每分钟催化一个微摩尔底物变化所需要的酶量 。酶的浓度可以 IU/L或 IU/mL来表示；当底物为蛋白质、多糖等含有多个能被酶作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔被作用的基团或键的变化来表示酶单位。如采用物理方法测定，应该在物理量与化学量之间建立对应关系进行换算 。 国际单位的应用有利于比较同一样品中不同酶的活力。但也有不少缺点，如 ： 从惯用单位换算成国际单位比较麻烦； 某些酶作用于 Mr不明的大分子底物 (如淀粉酶、胃蛋白酶等 )，采用底物减少法来定量时，无法计算其底物减少的微摩尔数； 同一种酶用不同的方法测定，换算成国际单位时，其结果仍不相同。欧美各国由于地理条件及实验室内温度的不同，常采用不同的测定温度，如25 、 30 、 37 等，这也导致即使用国际单位表示酶活力，其正常参考范围也是不同的。 （ 3） katal单位 1972年酶学委员会又提出一种新的酶单位katal(简称 kat)，即在确定的最适反应条件下每秒钟催化一摩尔底物变化所需要的酶量为 1kat单位。1kat = 6010 6 IU 1nkat = 0.06IU 1IU = 16.67nkat3.酶的比活力比活力 = 活力 /mg蛋白比活力越大，酶的纯度越高。4.酶活力的测定方法酶活力测定就是在一定时间内用分光光度法、荧光法、同位素法、电化学法、生物活性测定法等方法测定产物生成量或底物减少量。酶活力测定要符合两个原则： 在零级反应期测定，即 - s 或 p 与反应时间 t成正比； 反应速度与酶量成线性关系，即 E = k(- s / t) = k p / t 常用的方法有三种。（ 1）定时法 :测定酶反应开始后某一时间内 (t1到 t2)产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法称为定时法。因 t1和 t2是整个反应历程的两个点，故又称两点法，其中 t1一般取反应开始的时间，在酶反应进行一定时间 (t2)后终止反应，如加入强酸、 强碱、蛋白沉淀剂等，然后测定底物或产物的变化。 这种方法的 优点是简单 ，因最后测定产物时酶反应已被终止，故比色池无需保温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活力的影响。 缺点 是如果不用预试验确定，无法了解酶作用的这段时间内 是否都是零级反应 ，故很难保证测定结果的真实性。 因此，用定时法测定酶活力时，应先 做预试验来确定线性时间 ，并在线性时间内进行测定，否则，不能用 p 除以t来表示每分钟产生的 p ，并用其计算酶活力单位。 （ 2）连续监测法 :连续测定 (每 15s-1min监测一次 )酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。定时法只测定两个时间点，而连续监测法则进行多点连续测定。 这种方法的 优点 是可将多点的测定结果 ( s 或 p 的变化 )连接成线，很易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活力，不需要终止反应。也可在反应曲线的拐点处求出其切线的斜率，即初速度。连续监测法测定的结果通常较定时法高，也 较为准确 ，因为前者测定时间较短，而在酶反应的初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶的变性作用等均很小。 用连续监测法测定的 缺点 是因酶和底物边保温边测定的需要，仪器 (比色计或分光光度计 )必须有 保温装置 ，而且 产物 (或底物 )应是可被直接测定的化合物 ，且借以测定的特殊性质，必须与底物 (或产物 )有明显差别，否则，需加入其它试剂 (如显色剂、酶试剂等 )，将其转变成可测物质，但必须专虑到加入的酶试剂或显色剂对待测酶是否有影响。（ 3）平衡法 :通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法称为平衡法，或称 终点法 。因定时法是在酶反应的动态期进行测定，故需终止反应后才能测定，而平衡法则无需，因在平衡期中任何一点进行测定，底物和产物的量都不再变化。 用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不能把 p 或 s 的总变化量除以 t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响，由于反应时间较定时法更长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监测法低，不能代表初速度，也不是零级反应的速度。但是与定时法相同，只要待测标本与正常标本在相同