蛋白质组学与分析技术课第九讲

蛋白质组学与分析技术（第 九 讲）酵母双杂交技术基因敲除技术2010.5.05酵母双杂交技术主要内容o 酵母双杂交概念o 酵母双杂交的基本原理o 酵母双杂交系统的优缺点o 酵母双杂交系统的应用o 酵母双杂交衍生系统o 酵母双杂交技术未来展望 什么是酵母双杂交？酵母双杂交 (Yeast Two-Hybrid)， 简称双杂交系统 (Two-Hybrid System)，又称相互作用陷阱(InteractionTrap)，是 1989年由 Stanley Fields和Song等 在验证两个蛋白质间相互作用的亲和力时初步建立的，并在 Nature杂志上首先描述了这一系统， 该系统是 以酿酒酵（ S.cerevisiae） 为宿主，在酵母菌内研究蛋白质蛋白质相互作用的一种分子生物学方法。酵母双杂交正成为探索蛋白质相互作用最常用和最有力的工具。目前已被广泛地应用于真核基因的表达与调控、细胞黏合因子间的相互作用、信号传导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等诸多领域的基础研究及药物开发。酵母双杂交的基本原理酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录起始调控的认识。转录起始需要转录激活因子的参与，而真核生物转录激活因子大多是由结构上分离、功能上独立的两个结构域组成，即 DNA结合结构域 (DNA binding domain,简称为 DNA-BD)和转录激活结构域 (transcription activating domain,简称 AD)。 转录激活蛋白可以和 DNA上特异的序列结合，同时可启动相应因子的转录。它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的 DNA-BD和 AD都不能激活转录起始。但不同转录激活因子的 DNA-BD和AD形成的融合蛋白仍然具有正常的激活转录起始的功能。 结合结构域猎物蛋白激活结构域 与 DNA结合结构域 (DNA-BD) 融合的蛋白一般称为 “诱饵蛋白 ”(bait protein) 与转录激活结构域 (AD)融合的蛋白一般称为 “猎物蛋白 ” (prey protein)或 “靶蛋白 ”(target protein) 诱饵蛋白结合结构域报 告基因UAS 启动子 如果分别融合于 DNA-BD和 AD上的 “诱饵蛋白 ”和 “猎物蛋白 ”之间存在相互作用 , 那么 DNA-BD和 AD就能重新形成有活性的转录激活因子 , 从而激活相应报告基因(reporter gene)的转录与表达。 通过对报道基因表达产物的检测 , 反过来就可判别 “诱饵 ”和 “猎物 ”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。猎物蛋白激活结构域诱饵蛋白结合结构域猎物蛋白激活结构域报 告基因UAS 启动子激活酵母双杂交系统的优缺点1 酵母是真核细胞，表达的蛋白可保持天然状态在细胞中产生相互作用，一定程度上代表了细胞内的真实情况； 2 易于转化、便于回收扩增质粒，3 采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料来构建 cDNA文库，分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白； 4 具有很多营养缺陷型标记和特征报道基因 ,筛选方便； 5 高度敏感性，可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时性的相互作用； 6 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合，避免了对文库编码蛋白的干扰。 1 有些诱饵蛋白质本身具有激活转录功能使在无特异激活结构域情况下激活转录； 2 有些蛋白通常在细胞表面发生相互作用，不能稳定地在酵母中表达或定位于酵母细胞内； 3 有些 DNA-BD融合蛋白或 AD融合蛋白一部分可能封闭正常的作用位点，或者破坏了蛋白质的正确折叠，从而影响了蛋白间作用的能力； 4 有些蛋白质的正确折叠、修饰和功能有赖于其它非酵母蛋白的辅助，这限制了某些胞外蛋白（如哺乳动物）和细胞膜受体蛋白等的研究；5 有些蛋白质本身对酵母细胞具有毒性作用。优势 局限性酵母双杂交系统的应用1 检验对功能已知蛋白间的相互作用优点快速和高灵敏度，且反映了蛋白在体内的相互作用；还能检测出瞬间发生的信号反应，而用体外检测法检测蛋白要经过一系列洗涤过程，常致使相互作用不再发生。融合蛋白由于 BD和 DNA序列的相互作用而变得更加稳定。并且杂合蛋白一般都是由高拷贝质粒的强启动子过量表达的蛋白，在转录过程中产生了一些复合酶使信号得以放大。2 研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要的结构域，当证实了两个蛋白有相互作用后，可以对其进行缺失实验而找到相互作用发生所必须的氨基酸残基。通过该方法还能研究蛋白质的结构与功能。通常需要对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。 3发现新的作用蛋白质用已知功能的蛋白基因筛选双杂交 cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径，寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白，是双杂交系统最广泛和最有价值的应用。4 寻找具有药物治疗作用的小分子多肽通过双杂交系统筛选和目标蛋白相互作用的多肽，如靶蛋白是药物设计的目标，则有可能得到一些具有药物治疗作用的小分子多肽药物。5分析新基因的生物学功能即以功能未知的新基因蛋白克隆在 BD载体上，而把将要筛选的 cDNA文库克隆在 AD载体上，利用双杂交技术可以找到一个新的结合蛋白，这个结合蛋白可能是已知基因也可能是未知基因所编码，然后根据调到的已知基因的功能推测该新基因的功能。6寻找调控蛋白相互作用的 蛋白，在恢复转录活性的双杂交系统中加入某一分子化合物后再检测报告基因的表达强度，可用来寻找抑制蛋白质之间相互作用的小分子化合物。 7 蛋白质相互作用图谱的构建随着基因组研究计划的开展，及mRNA在不同组织器官的不同发育阶段表达图谱的构建，蛋白在不同时空状态下相互作用图谱的构建也逐渐展开。酵母蛋白质相互作用的横向研究是近年来双杂交系统最引人注目的应用，用以揭示多种细胞活动过程中各控制因子间的联系。酵母双杂交技术应用的趋势及展望 酵母双杂交技术问世至今十多年来，已经在蛋白质间的相互作用研究、筛选新的蛋白、研究蛋白质的功能等诸多方面发挥了重要作用。该技术已经成为许多实验室研究蛋白质的相互作用和蛋白质的结构与功能的必备手段。目前除了应用双杂交系统继续寻找和靶蛋白起相互作用的新蛋白外，相当一部分的实验重点已放在如何利用双杂交系统作为媒介来研究蛋白相互作用的调控机制以及寻找蛋白联系图谱，这在后基因组时代更具意义。 交链孢菌植物激活蛋白信号传导机理的研究 应用实例利用酵母双杂交技术，即将交链孢菌植物激活蛋白目的基因克隆在 DNA-BD载体上 ,将拟南芥cDNA文库或番茄 cDNA文库克隆在 AD载体上，在酵母中进行表达筛选，可得到目的基因的互作蛋白，然后针对互作蛋白进行植物激活蛋白信号传导机理的研究。技术路线图酵母双杂交体系的实验程序 诱饵蛋白自激活作用检测待筛 cDNA文库片段克隆在 AD质粒载体上把 cDNA文库质粒转化到含诱饵载体 BD-X的感受态酵母菌内检测挑选阳性克隆酵母质粒 DNA提取并转化大肠杆菌提取细菌质粒酶切鉴定明确与已知靶蛋白 X相作用的 Y蛋白的核苷酸序列待筛 cDNA文库 质粒的准备将已知靶蛋白质 X的编码基因插入BD质粒载体，构建诱饵载体酵母双杂交衍生系统o 单杂交系统（ One-hybrid system）o 三杂交系统（ Three-binding hybid system）o 反向双杂交系统（ Reverse two-hybrid system）o 无核双杂交系统（ Non-nuclear two-hybrid system）单杂交系统o 单杂交系统是 1993年发展出来的一种研究蛋白质和 DNA相互作用的实验体系，用于确定识别特异 DNA结合蛋白。o 在该系统中，转录激活域 AD相融合的待筛选蛋白质 Y直接与DNA结合位点相结合，使 AD直接激活启动子下游报告基因的表达。这一过程无需 BD-X的参与，因而通过对 AD-Y文库的筛选可分离出与靶 DNA序列直接作用的蛋白质 Y。2 酵母单半杂交系统 酵母单半杂交系统 (one-and-a-half hybrid system)也是一种筛选 DNA结合蛋白的方法，它结合了单杂交系统和双杂交系统的特点。是专门用来鉴别那些只有在与第二个已知配体以异二聚体形式复合时才结合 DNA的蛋白质，或者用来鉴别那些不能自主结合 DNA、但在有附属蛋白质存在时可以形成稳定的三维复合物的蛋白质。 另外，还出现了一些由双杂交系统衍生而来的既能筛选蛋白蛋白相互作用又能筛选蛋白 DNA相互作用的酵母单双杂交系统（ one-two-hybid system） 等，但应用都没有双杂交系统广泛。3 酵母三杂交系统 近几年来，以双杂交思想为基础建立起来的三杂交系统（ three-binding hybid system） 可用来研究多至三个分子间的相互作用。两个蛋白之间通过第三者发生相互作用，第三物可以是蛋白质、小分子、或 RNA。 三杂交系统o 两个蛋白之间通过第三种成分，如：联结蛋白、修饰酶、RNA或小分子量的化合物构建了三杂交系统 。o 在酵母三杂交系统的最初实验中，糖皮质激素受体与地塞米松 FK506联结用于捕捉 FK506结合蛋白 。反向双杂交系统反向双杂交系统提供了简便的鉴定阻断蛋白间相互作用的方法。这项技术的关键是报道基因 URA3的引入。 URA3基因在这里起到了反向选择的作用，它编码尿嘧啶合成的关键酶，同时它又可催化5-氟乳清酸（ 5-FOA） 转化为对细胞有毒的物质。 Vidal等将 URA3基因的启动子内引入 GAL4的结合位点，从而改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择培养基上只有当 “诱饵 ”和 “猎物 ”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。而在含有 5-FOA的完全培养基上 “诱饵”和 “猎物 ”的相互作用则抑制细胞的生长。如果目的蛋白，即与 BD或 AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用， URA3基因不能表达，则细胞能在含有 5-FOA的完全培养基上生长。因此可通过筛选 5-FOA抗性克隆从随即突变库中鉴定出下调蛋白相互作用的突变体。反向双杂交系统可更有效地反应蛋白质间作用的位点或起决定作用的个别氨基酸，进而分析蛋白结构和功能的关系。无核双杂交系统经典的酵母双杂交系统局限性之一是不适合转膜蛋白的相互作用。现在，在基因组范围内的酵母双杂交对转膜蛋白的研究甚少，近几年来，其他几种酵母双杂交系统已经鉴定了膜蛋白和细胞质蛋白相联系的蛋白质的相互作用。其中包括反向 Ras补充系统， G蛋白融合方法和分离泛素膜蛋白酵母双杂交技术。酵母双杂交技术应用的趋势及展望 酵母双杂交技术问世十多年来，已经在蛋白