蛋白质组学与肿瘤ppt课件

蛋白质组学与肿瘤研究 1 摘要 l肿瘤标志物是细胞在特定疾病状态下的分子信号 , 是检测、诊断、治疗、监测肿瘤和判断肿瘤预后 的重要工具。如何发现新的、具有高度特异度和 灵敏度的肿瘤标志物多年来一直是肿瘤研究的热 点之一。蛋白质和蛋白质组学研究的快速发展给 肿瘤标志物研究注入了新的活力。运用比较蛋白 质组学研究揭示肿瘤发病机理，寻找肿瘤诊断和 治疗的靶标，血清蛋白质组学研究寻找肿瘤相关 抗原，是蛋白质组学寻找肿瘤标志物的主要路线 。目前运用蛋白质组学方法已在多种肿瘤如肺癌 ，肝癌，胃癌，结直肠癌，膀胱癌，肾癌等中找 到有差异表达的蛋白质，这些蛋白有望成为有效 的肿瘤标志物。 2 蛋白质组学与肿瘤研究 v一 什么是蛋白质组学 v二 肿瘤产生的相关机理 v三 蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 v四 前景与展望 3 技术与平台 样品制备 蛋白质分离 蛋白质鉴定 生物信息学 4 ， 蛋白质组学与肿瘤研究 （一）蛋白质组学 蛋白质组（ proteome）一词由 Wilkins于 1994 年首次提出，意指一个细胞或一个组织的基因组所 表达的全部蛋白质。它是一个在空间和时间上动态 变化着的整体。蛋白质组学（ proteomics）是指应 用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科， 其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白 质组成成分，表达水平与修饰状态，了解蛋白质之 间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命 活动规律 5 蛋白质组学与肿瘤研究 v 技术与平台 v （ 1） 样品制备 通常使用蛋白质样品溶解液 或细胞裂解缓冲液从细胞，组织或其他体液中尽 可能完整地将蛋白质以溶解状态提取出来，并将 其他杂质（ DNA，糖类，脂类等）去除。 LCM 3（ laser capture microdissection，激 光捕获微切割）技术是最近发展起来的一种提取 肿瘤细胞的技术，成功地解决了组织中的细胞异 质性问题，是提取肿瘤细胞最理想的方法。 6 蛋白质组学与肿瘤研究 v （ 2）蛋白质分离： 目前，蛋白质组学研究中蛋白质分离 的主流技术仍然是 双向凝胶电泳（ two-dimensional gel electrophoreus， 2-DE），但是，以 2-DE为基础的蛋白质 组学技术存在固有的缺陷：上样量的限制使低丰度蛋白质 难以检测到，低溶解度和极大（ 200 kD）、极小（ 10 kD）和极端等电点值（ pI）蛋白无法进入 2-DE技术的有效 分离范围内，故难以通过 2-DE技术进行分析。目前多采用 多维色谱技术。在蛋白质组学的定量研究方面，荧光差示 电泳（ differential gel electrophoresis， DIGE）技术以及同 位素亲和标签技术（ isotope coded-attinity tags， ICAT）， 可实现对蛋白质的定量分析 1。 v 。 7 v（ 3）蛋白质鉴定 蛋白质鉴定主要包括 氨基酸组成分析，序列分析， 肽质量指纹 图分析和肽序列标签分析 等。其中，肽质 量指纹图（ poptide mass finger print， PMF）分析是对蛋白质酶解后的多肽混合 物进行质谱分析。质谱鉴定的主要原理是 根据样品电离后样品离子的质量电荷比（ m/z）的差异分离样品 8 v（ 4）生物信息学：生物信息学是随着人类基 因组计划、计算机技术、网络技术的发展而 诞生的一门新兴学科，它是蛋白质组学研究 中不可缺少的一部分。生物信息学在蛋白质 组学研究中有两个重要应用： 一是分析和构 建双向凝胶电泳图谱， 二是搜索与构建蛋白 质组数据库。 目前应用最普遍的数据库是 NRDB和 dbKST数据库。 9 v（二）肿瘤产生的相关机理 中医观点 ：一般正常人的气升降出入，是循环畅通的。但 在内、外因素影响下，致使气的功能失调，引起气的郁滞。 气滞日久，必然血瘀；气滞血瘀，积久成块 。或由于火毒内 蕴，情志化火血遇火则凝结，气血紊乱，堵塞经络，久则凝 结成块。大多数癌瘤，是由于情志郁结，过于劳累，饮酒过 多，或病毒侵袭。或某些特别刺激，致使生理机能反常，局 部组织变形、变性。 从分子水平看 ：肿瘤是由于 DNA RNA病毒等生物因素， 亚硝胺类等化学因素， X射线等物理因素引起细胞内蛋白质 等的结构发生改变而引起的，特别是蛋白质的改变，因此我 们研究蛋白质对于抗肿瘤特别有意义。 10 v v v 肺肿瘤 11 12 v 胸部肿瘤细胞 细 13 14 （三）蛋白质组学在肿瘤研究中 的应用 （ 1）比较蛋白质组学 ：运用蛋白质组学研究技术，比较 肿瘤 组织（细胞 ） 与其起源的 正常组织（细胞） 或肿瘤发展不同 阶段组织中蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差 异，可以发现与癌变相关的 特异蛋白质 ，这些肿瘤相关的特 异蛋白质不仅可为研究肿瘤发病机理提供线索，而且可作为 肿瘤诊断和治疗的生物标志物 7 例如将肿瘤相关基因转 染细胞，制备肿瘤相关基因转基因小鼠、基因敲除小鼠或利 用 RNA干扰技术封闭其表达，再应用蛋白质组学技术分析相 应模型蛋白质组的变化，有可能发现肿瘤相关基因所调控的 蛋白质，为揭示其功能和致瘤机理提供线索 15 v（ 2）血清蛋白质组学 从肿瘤 免疫学的观点来看，肿瘤细胞是 “非已细 胞 ”，肿瘤细胞总是或多或少地表达区别 于正常细胞的肿瘤抗原，因而，在患者 血清中极有可能存在其相应的抗体。 可分为四步： 16 （ 1） 首先采用 2-DE分离肿瘤组织、癌旁正常 组织的蛋白质 （ 2）与患者或正常人血清中的某一类免疫球 蛋白建立 Western blot 反应图谱，通过计算 机分析确定差异反应的蛋白质斑点 （ 3）采用质谱分析和生物信息学方法对平行 胶（ replica gel）中相应的差异蛋白质点进 行鉴定，筛选出肿瘤相关抗原 （ 4）用其他肿瘤组织和正常组织对肿瘤相关 抗原的特异性进行分析 17 v（ 3）蛋白质芯片 以蛋白质或 多肽为材料，可以从微量的样品中检测 成千上万个蛋白质或多肽，用于分析差 异表达的蛋白质及药物靶标的筛选和鉴 定 。 目前应用最多的是表面增强激光 解吸离子化（ SELDI）蛋白质芯片技术 。 18 蛋白质芯片技术 v应用方法： 首先将 100 l血点在蛋白芯片上，再经 过特别的生物芯片检测仪分析，就可对常见的肝癌 、肺癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢 癌、胰腺癌、前列癌癌和子宫内膜癌等 10多种癌症 进行早期筛查，能极大地提高癌症早期检出的敏感 性和特异性 19 蛋白质芯片技术 v原理：间接法 第二抗体 抗体 抗原 这套检测系统是利用目前最先进的高科 技生物芯片制备技术、酶联免疫、化学发光 及抗原抗体结合的双抗体夹心法原理，在固 相基质上包被 12种肿瘤标志物的抗体，捕捉 被检者血清中对应的肿瘤标志物（即抗原） ，结合第二抗体 （标有示踪标记物）， 催化 化学反应产生光信号并进行定量检测 20 蛋白质芯片技术 v 据北京、上海、广州、深圳等多家大型医院的检测报告，其准确率高 达 80以上，该技术检测范围广，检出率高，适用于无症状人群的 癌症筛查，癌症患者治疗结果的评价及复发转移的动态监测 v 肿瘤细胞 21 研究进展 1肺癌：肺癌是当今世界各地最常见的恶性肿瘤之一 ，也是我国的多发癌症之一，且发病率呈不断增长趋 势。在细胞，组织以及血清中都发现有差异表达的蛋 白质或肿瘤相关抗原。如在细胞水平， Jong 等 9应 用蛋白质组学技术分析比较人恶性上皮细胞（ A549 ）和正常上皮细胞，发现 Peroxiredoxin I可作为一 个有价值的肿瘤标记物和肺癌药物治疗的靶标。詹显 全等 10用双向凝胶电泳及飞行时间质谱法分析了人 肺鳞癌细胞 NCI-H520蛋白质组分，以及人肺腺癌细 胞 A-549和正常细胞 HBE的蛋白质组差异，结果补充 到了人肺癌细胞蛋白质组数据库。 22 2肝癌：肝细胞癌是非洲、中国和东 南亚国家最常见的恶性肿瘤之一。肝细 胞癌的发生与 HBV 和 HCV 感染有关。 Seow等 13分析了人肝癌细胞株 HCC -M的蛋白质表达图谱，并对 408个点进 行了质谱分析。除了一些看家蛋白外， 还检测到了可能与癌变有关的蛋白，如 14-3-3蛋白、膜联蛋白、抗增殖蛋白和 硫氧还蛋白过氧化物酶。 23 3胃癌： Ryu 等 20对 11 例胃癌患者组织标本及 其正常和切缘组织进行 2-DE 分析，每例癌组织大约 产生 1 500 个蛋白质点。他们对癌和正常组织之间有 明确表达差异的蛋白质点进一步做 MALDI-TOF质谱 鉴定，结果有 7种蛋白质在癌组织中过表达，包括 NSP3、 transgelin、 prohibition、 HSP27等， 同时也发现阿朴脂蛋白 A1、 p20、核苷二磷酸异构酶 A等 7种蛋白质在癌组织中低表达。 Sinha等 21对耐 热的人胃癌细胞系进行研究，发现 stratfin、细胞角 蛋白 7 9、 calreticulin、葡萄糖调节蛋白 78、 HSP（ hsp27、 hsx70 变异体、 hsp27 变异体） 在细胞系中过表达，而 annexin-1、脂皮素 1 变异体 、启动因子 5A 及其变异体等在细胞系中低表达。 24 4肾癌：意大利 Sarto等 25将 10个肾癌组织和 10 个正常肾组织的蛋白质双向电泳图谱进行对比分析， 发现有 4种蛋白质在肾癌中缺失，其中谷胱甘肽过氧化 物酶两种异构体、锰超氧化物歧化酶（ Mn-SOD）单 体只出现在正常组织中，而 Mn-SOD多聚体只出现在 肿瘤组织中，该蛋白与线粒体氧化还原功能有关，说 明线粒体氧化还原功能障碍在肾癌的发生、发展中起 重要作用。通过生物信息学进一步分析发现，该蛋白 质表达变化与染色体结构变化存在着相关性，认为这 种蛋白可以作为肾癌的诊断标志物 25 5鼻咽癌：鼻咽癌是我国（尤其是华南地区 ）及东南亚常见的一种恶性肿瘤，在世界其他 国家或地区较为少见。中南大学湘雅医学院肿 瘤研究所与湖南师范大学生命科学院 24率先 采用双向凝胶电泳和质谱技术分析了人鼻咽癌 细胞系 HONE1的总蛋白质，鉴定出 10种在 HONE1细胞系中表达较强的蛋白质，包括胰 岛素样生长因子（ ILGF），白细胞介素 -14（ IL-14），癌蛋白 WNT-2 和丝裂原激活蛋白激 酶 -8（ MAPK-8）等 26 v *最新研究 * NCI和 FDA的研究者们认为 ，一项新的技术可以帮助临床医生监测病人 对分子靶向药物的反应。这项新技术就是蛋 白质组学的三个新进展之一： 细胞内蛋 白质的研究 。这项新技术本来是准备在 94届美国癌症研究联合会年会上报告的，但 是那次年会取消了。 27 v 第一次研究中，人们成功地找到了特异的蛋白质用于监测乳癌和卵巢癌 病人。方法是基于 肿瘤细胞中活性蛋白质浓度的改变 ，从而帮助 大夫在治疗的早期鉴别所用的药物对病人是否有效 。科学家们不仅测量 每种蛋白质的总量，而且测出活性蛋白质的量。在治疗前测量一次，在 治疗中挑选几次测量。他们发现， 治疗前 ，临床结局不好的乳腺癌病 人通常有 更多的活性蛋白，如 AKT，可以促进细胞的生存。用 Herceptin治疗后， AKT含量降低，促进了肿瘤细胞死 亡 。 NCI临床蛋白质组学的指导者之一 Lance Liotta说： “用 Herceptin 似乎可以改变肿瘤细胞中 AKT的浓度。我们或许可以通过测量接受这种 治疗的病人的 AKT浓度，从而鉴别阻止这条信号通路是否对这个病人有 效 ”。研究者们希望蛋白质组学的技术可以用于监测其他肿瘤靶向药物治 疗的效果 ,但是还需要进一步研究那些肿瘤中最适合的蛋白质。 28 （四）前景与展望 v（美国国家癌症研究所） NCI虽为 NIH的下属 单位，但其财政预算直接由国会审定，资金 充沛， 2005财政年度的研究预算更是达到 48.7亿美元，较 2004年的执行预算 47.7亿美 元增加约 2.8%。 近 5年来， NCI的全职工作 人员保持相对稳定，而经费由 2001年的 32.7 亿美元升至 2005年的 48.7亿美元， 增加约 48.9% 29 前景与展望 v 近年来蛋白质组学技术发展迅速，已经成为后基因 组时代研究的热点和主流。 1986年世界上第一个蛋 白质序列数据库 SWISS-PROT建立至今，大量的人 类正常组织和病理组织数据库纷纷建立。随着蛋白 质组信息学的迅速发展，蛋白质组学技术已经发生 质的飞跃，但还远未完善。在肿瘤研究方面，存在 着肿瘤组织中细胞种类繁多、难以获取单一的肿瘤 细胞、制备纯化的肿瘤细胞蛋白质困难、肿瘤发生 发展中的低丰度蛋白难以分辨等问题。此外， Celis 等还发现，即使经过短暂的体外培养，肿瘤细胞的 关键蛋白也会发现明显变化。这些问题都为肿瘤蛋 白质组学的研究提出了新的挑战 30 v 随着新技术的不断产生，如激光捕获微切割（ laser capture microdissection， LCM）技术，可从多种细胞混合的