t载使用中常见问题

Q-1：TA 克隆的原理? 大部分耐热性 DNA 聚合酶进行 PCR 反应时都会在 PCR 产物的 3末端添加一个“A”，T 载体是 3带有一个“T”的载体，在连接酶作用下，完成连接，其连接液可以直接用于细菌转化，大 大方便了实验操作。TA 克隆的原理请见下图： Q-2：蓝白斑筛选的原理? 蓝白斑筛选原理是：载体上携带一段细菌的 lacZ 基因，它编码 -半乳糖苷酶的一段 146 个氨 基酸的 -肽，载体转化的受体菌为 lacZM15 基因型。这样，载体同宿主通过互补，具有完 整的 -半乳糖苷酶的活性。如果在载体的 lacZ 基因中插入外源 DNA，造成 lacZ 基因缺失，不 能合成 -肽，失去同宿主的互补，不能形成有功能的 -半乳糖苷酶，失去分解 X-gal 的能力。 在 X-gal 平板上，含阳性重组体的细菌为白色菌落（质粒载体）或无色噬菌斑（M13 噬菌体载 体） ；非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。 Q-3：Takara 有哪些常用的 PCR 产物克隆用 T 载体，各有什么特点? 常用的 PCR 产物克隆用 T 载体及各自的特点请见下表： Code No. 产品 特点 应用 3275 pBackZero-T Vector Cloning Kit 由 pUC19 改建，阳性克隆率极高而背景极 低。它消除了 pUC19 载体上的 lacZ 基因及 多克隆位点，并对 -lactamase ( bla) 基因进行了独特的改造，可以定向克隆。 使用时需在待插入的 DNA 片段的上、下游 Primer 的 5端加上 TTTAA 5 个碱基。如果需 要进行定向克隆，只需在一条引物的 5端加上 TTTAA 5 个碱基。 PCR 产物 3端有“A”，TA 克隆。 6011 pMD18-T Vector Cloning Kit 由 pUC18 构建，含有多克隆位点，可以进 行蓝白筛选，无方向性克隆。 PCR 产物 3端有“A”，TA 克隆。 6013 pMD19-T Vector Cloning Kit 由 pUC19 构建，含有多克隆位点，可以进 行蓝白筛选，无方向性克隆。 PCR 产物 3端有“A”，TA 克隆。 3271 T-Vector pMD19 (Simple) 由 pUC19 构建，不含有多克隆位点，可以 进行蓝白筛选，无方向性克隆。 PCR 产物 3端有“A”，TA 克隆。根据实验需 要，可以在引物的 5端导入酶切位点。 6012 pSIMPLE-19 EcoR V /BAP Vector 由 pUC19 构建，不含有多克隆位点，是种 平末端去磷酸化载体，可以进行蓝白筛选， 无方向性克隆。 与 5端磷酸化的平末端 PCR 产物进行连接。 3270 T-Vector pMD20 由 pUC19 构建，含有多克隆位点；并对 lacZ 基因进行改造，降低假阳性，可以进 行蓝白筛选，无方向性克隆。 PCR 产物 3端有“A”，TA 克隆；含有 SP6 Promoter，可以对插入的 DNA 进行体外转录。 Q-4：pMD19-T Vector 与 pMD18-T Vector 相比，有何不同? pMD19-T Vector 与 pMD18-T Vector 相比，-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时 间缩短，菌落显示的蓝色更深。pMD18-T Vector 连接转化后，一般要经 37过夜培养，然后再 将其于冰箱内放置一段时间后，其蓝白菌落才能显色。而 pMD19-T Vector 涂板培养后一般只需 10 个小时（37）便可以显色。因此，pMD19-T Vector 比 pMD18-T Vector 更适合于蓝白菌落 的筛选。 Q-5：使用 Takara 的 T 载体，对感受态细胞有什么要求? 转化时请使用高效的感受态细胞（转化效率110 8 cfu/g pUC19），这样才可能得到比较 理想的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F编码的 lacZM15）产生 Fragment，才可能和载体 DNA 产生的 lacZ 多肽相结合，表现出 -半乳糖苷酶活性（-互补性），才可以进行蓝白筛选。通常使用的 JM109，DH5 等细胞均 可进行蓝白筛选。 Q-6：使用 Takara 的 T 载体，对 Insert DNA 有什么要求? 使用 Takara 克隆用 T 载体，对 Insert DNA 有以下的要求： 1Insert DNA 应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的 存在。切胶回收时可使用 Takara 凝胶回收试剂盒（Code No. 9762） 。 2Insert DNA 的使用量及计算方法。 进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比一般为 1：310，可以根据具体的实验情 况选择合适的 Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比。 Insert DNA 使用量的计算方法如下： Insert DNA 的使用量（ng）=nmol 数660Insert DNA 的 bp 数 Takara 的 T 载体 1 l（50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol。 Q-7：如何计算感受态细胞的转化效率? 取 0.1 ng 的 pUC19 Plasmid DNA 加入至 100 l 的感受态细胞中进行转化，再加入 900 l 的 SOC 培养基（0.1 ng DNA/ml） ，将上述培养液稀释 10 倍后（0.01 ng DNA/ml）取 100 l 涂 布平板（0.001 ng DNA/100 l） ，记录菌落数。以得到 200 个克隆体为例计算转化效率，此时 的转化效率=200 cfu/0.001 ng=210 5 cfu/ng=2108 cfu/g pUC19 DNA。 Q-8：使用 Takara 的 T 载体，转化后的菌落全为蓝色（或淡蓝色） ，但有目的 DNA 片段的插入， 为什么? 插入的 DNA 片段较短（小于 500 bp） ，且插入片段没有影响 lacZ 基因的读框，此时平板培养基 上出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色） 。 Q-9：使用 Takara 的 T 载体，怎样提高连接转化效率? 应该从以下几点进行改善 1确认 Insert DNA 片段的 3末端是否带有“A”尾。大部分的高保真 DNA 聚合酶（如： Pyrobest、PrimeSTAR HS、KOD、 Pfx、 Pfu 等）扩增的 PCR 产物是平滑末端，不能直接进行 TA 克隆。 2纯化 PCR 产物。最好使用切胶回收的 PCR 片段，以除去 PCR 产物中的非特异性片段和引物等 杂质。进行切胶回收时可以使用 Takara 凝胶回收试剂盒（Code No. 9762） 。 3请使用转化效率大于 108 cfu/g pUC19 DNA 的感受态细胞。 4DNA 片段的立体结构、DNA 片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段 DNA 的克隆 效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。 5进行切胶回收纯化 DNA 片段时，不要使 DNA 片段在紫外线下暴露时间过长。 6Solution I 应尽量避免反复冻融。 7建议使用新配制的平板培养基。 Q-10：使用 Takara 的 T 载体，欲对克隆 DNA 片段进行测序时，使用何种引物? T 栽使用说明 通常使用载体的通用引物进行测序。 1pMD18-T Vector 来源于 pUC18 载体，M13-47 和 RV-M 等 pUC18 载体测序的通用引物都可以使 用。 2pMD19-T Vector、T-Vector pMD19 (Simple)和 pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector 来源于 pUC19 载体，M13-47 和 RV-M 等 pUC19 载体测序的通用引物都可以使用。 3T-Vector pMD20 来源于 pUC19 载体，M13-47 和 RV-M 等 pUC19 载体测序的通用引物都可以 使用。 Q-11：使用 Takara 的 T 载体，需要注意哪些问题? 1 Solution I 请于冰中融解。 2克隆时使用的 Insert DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则 PCR 产物中 的短片段 DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段） 、残存引物等杂质都会影响 TA 克隆效率。 3按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过 20 l。当要转化的 DNA 量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化 DNA 后再进行转化。进 行乙醇沉淀时使用 Dr.GenTLE Precipitation Carrier（Code No. 9094）可以提高 DNA 的 回收率。 4连接反应请在 25以下进行，温度升高（26）较难形成环状 DNA。连接效率偏低时， 可适当延长连接反应时间至数小时。 5Takara 克隆用 T 载体来源于 pUC18 或 pUC19 载体。因此，适合 pUC18 和 pUC19 载体的 感受态细胞都可以使用，如：JM109 等。 Q-12：使用 Takara 的 T 载体，阳性克隆鉴定方法有哪些? 阳性克隆的鉴定方法有多种，主要的方法有以下几种： 1蓝白斑筛选。 蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，一般情况下，-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克 隆体在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短 的 DNA 片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与 lacZ 的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝 色菌落。有报道称，2 kb 的 DNA 片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我 们没有得到白色菌落时，可以试着检测蓝色菌落。 2菌落 PCR 方法。 以变性后的菌液为模板，使用载体通用引物进行 PCR 扩增鉴定。 使用灭菌后的牙签挑取白色菌落，在预备好的 dH2O（10 l）中蘸洗，99，10 min 变性，冰 上急冷，加入配制好的 PCR 混合液（引物，dNTP，Buffer， TaKaRa Taq 等）。 94 1 min 94 30 sec 55 30 sec 30 Cycles 72 1 kb/min 说明： a所用引物通常为载体通用引物。 Takara 克隆用 T 载体的通用引物为 BcaBEST Primer RV-M 和 BcaBEST Primer M13-47，序列详 见载体说明书。 b扩增产物的大小为载体通用引物之间大小+插入片段大小。 Takara 的 T-Vector pMD20 通用引物之间大小约为 200 bp，其它的载体为 150 bp 左右。 3质粒 PCR 方法。 以提纯后的质粒 DNA 为模板，使用 PCR 扩增引物进行 PCR 扩增鉴定。 94 1 min 94 30 sec 55 30 sec 30 Cycles 72 1 kb/min 说明：扩增产物的大小就是 PCR 产物的大小。 4酶切方法。 利用载体多克隆位点上限制酶或者 PCR 引物导入酶切位点的限制酶，对提纯后的质粒 DNA 进行 双酶切鉴定。 说明：双酶切后，电泳显示两条带，分别为载体大小和 PCR 产物的大小。 Q-13：使用 Takara 的 T 载体，进行菌落 PCR 阳性鉴定时，使用 PCR 扩增用引物检测为阳性，但 测序却为假阳性结果，为什么? 作为模板的菌落中，若混杂有微量的 PCR 产物，使用 PCR 扩增用引物就能检测到目的条带，而 并非菌落自身扩增的 PCR 产物。为了避免出现假阳性现象，建议使用载体上的通用引物作为鉴 定阳性克隆的扩增引物。 Q-14：使用 Takara 的 T 载体，如何鉴定插入片段的方向? TA 克隆没有方向性，但是可以通过以下方法进行方向的鉴定。 1PCR 方法。 使用载体上的一条通用引物和 PCR 扩增的一条引物，分别作为 PCR 扩增的上下游引物，对阳性 克隆进行 PCR 扩增，通过是否有扩增产物来判断片段插入的方向。 2酶切方法。 利用载体多克隆位点上的一个限制酶和 PCR 引物导入的酶切位点的一个限制酶，对阳性克隆质 粒 DNA 进行双酶切鉴定。 Q-15：使用 Takara 的 T 载体，阳性对照实验（Control Insert）有什么意义? 为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验。按照实验操 作方法，使用试剂盒中提供的 Control Insert，可以进行 10 次阳性对照实验。 Q-16：使用 DNA A-Tailing Kit，怎样提高克隆效率? 可以从以下几点进行改进： 1. 为了提高加“A”反应效率，用于加“A”反应的末端平滑 DNA 片段应进行切胶回收的纯化处 理，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用 Takara 凝胶回收试剂盒（Code No. 9762） 。 2. 请使用转化效率大于 108 cfu/g pUC19 DNA 的感受态细胞。 3. DNA 片段的立体结构、DNA 片段