组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合hpv16e7―dna疫苗治疗宫颈癌的效果及机制研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合 HPV16E7DNA 疫苗治疗宫颈癌的 效果及机制研究 摘要 目的 探组蛋白去乙酰 化酶抑制剂（HDACI）伏立诺他 （SAHA）联合人乳头瘤病毒 16 E7- DNA（HPV16E7-DNA）疫苗治疗宫颈 癌的效果及免疫机制。 方法 建立 TC- 1 宫颈癌小鼠模型，负瘤第 5 天，采用 随机数字表法将小鼠分为 HPV16E7- DNA 组、SAHA 组、SAHA 联合 HPV16E7-DNA 组、对照组，用药方案： HPV16E7-DNA 组给予疫苗 5 g/kg，SAHA 组给予 SAHA 20 mg/kg，SAHA 联合 HPV16E7-DNA 组 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 给予疫苗 5 g/kg+SAHA 20 mg/kg，对 照组给予 100 L 磷酸盐溶液（PBS） 。 每 3 天 1 次，共 4 次。绘制肿瘤生长曲 线；流式细胞仪检测各组小鼠外周血 CD8+T 细胞的数量；体外实验检测不 同剂量 SAHA（25.0、12.5 nmol/L）对 TC-1 细胞 MHC类分子 H-2Kb 表达的 影响。 结果 与其他三组比较，SAHA 联合 HPV16E7-DNA 组的肿瘤生长速度 明显减慢，小鼠外周血 HPV16E7 特异 性 CD8+T 细胞的数量增高（P 0.05） 。 结论 HDACI 联合 HPV16E7-DNA 疫 苗可能通过上调肿瘤细胞 MHC类分 子的表达，激活机体 CD8+T 细胞免疫 反应，从而产生明显的抗肿瘤效应，有 望用于宫颈癌的免疫治疗。 中国论文网 /6/view-12954572.htm 关键词 组蛋白去乙酰化酶抑制 剂；HPV16-E7 疫苗；宫颈癌；CD8+T 细胞；MHC类分子 中图分类号 R737.33 文献标识 码 A 文章编号 1673-7210（2018） -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 02（b）-0018-04 Abstract Objective To investigate the effect of combination of histone deacetylase inhibitor （HDACI） Suberoylanilide Hydroxamic Acid （SAHA） combined with human papilloma virus 16 E7-DNA （HPV16E7- DNA） vaccine in the treatment of cervical cancer and its immunological mechanism. Methods The model of mice with TC-1 cervical cancer was made， then on the 5th day after tumor bearing， the mice were randomly divided into HPV16E7-DNA group， SAHA group， SAHA and HPV16E7-DNA group， control group by random number table method. The therapeutic regimen was as followed： HPV16E7-DNA group was given vaccine 5 g/kg， SAHA group was given SAHA 20 mg/kg， SAHA and HPV16E7-DNA group was given vaccine 5 g/kg+SAHA 20 mg/kg， the control -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 group was given 100 L phosphate solutions （PBS）. Once every 3 days， total for 4 times. The tumor growth curve was drawn； the amount of CD8+T cells in peripheral blood of mice in each group was detected by flow cytometry； the effects of different doses of SAHA （25.0， 12.5 nmol/L） for the expression of H-2Kb of MHC class in TC-1 cells were detected by experiment in vitro. Results Compared with the other three groups， the tumor growth rate in SAHA and HPV16E7-DNA group was significantly slowed down， the amount of HPVE7 specific CD8+T cells in peripheral blood of mice was significantly increased （P 0.05） . Conclusion HDACI combined with HPV16E7-DNA vaccine comes into significant anti-tumor effects may be through up-regulating expression of MHC class of the tumor -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 cells and activating the immune response of CD8+T cells， which is expected to be used in the immunotherapy of cervical cancer. Key words Histone deacetylase inhibitor； HPV16E7-DNA vaccine； Cervical cancer； CD8+T cells； MHC class 宫颈癌在全球妇女的癌症死因中 居第 2 位，严重威胁女性健康。高危型 人乳头瘤状病毒（HR-HPV）是宫颈癌 发生的主要病因，HPV16 病毒基因 E7 是主要致癌基因。宫颈癌传统的治疗包 括手术、放疗及化疗等，治疗创伤大， 不能防止 HPV 再次感染1。以 HR- HPVE7 为靶点研制治疗性 DNA 疫苗， 将为宫颈癌的防治开辟一条全新的途径， 但是 DNA 疫苗本身的免疫原性弱，单 独应用并不能起到良好的抗肿瘤效应2- 3。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACI ）与 DNA 疫苗联合应用，能增加 DNA 疫苗编码 蛋白质的表达，上调 MHC、类分 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 子的表达，从而增强 DNA 疫苗的抗肿 瘤免疫效应4。本研究制备 HPV16E7- DNA 疫苗，联合 HDACI 类药物伏立诺 他（Suberoylanilide Hydroxamic Acid，SAHA）对宫颈癌负瘤小鼠进行 免疫治疗，探讨其对宫颈癌的治疗效果 及其可能的免疫机制。 1 材料与方法 1.1 细胞株来源及培养 小鼠宫颈癌细胞系 TC-1 由美国 霍普金斯大学医学院 TC WU 教授惠赠。 细胞培养于含 10%小牛血清的高糖 DMEM 培养基中，置于含 5%CO2 的 37培养箱中，0.25%胰酶消化传代， 12 d 更换培养液。 1.2 HPV16E7-DNA 疫苗的制备、 纯化及检测 以大肠埃希菌作为表达载体， pcDNA3.1（ +）作为表达质粒， BamHI/XhoI 作为限制性核酸内切酶， 构建 HPV16E7-DNA 疫苗。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 1.3 试剂的购买与配制 SAHA 购自购于 Cayman 公司， 为白色粉末，使用二甲基亚砜 （DMSO）溶液给予溶解稀释备用。抗 PE-HPV16-E7 四聚体由商业公司合成。 FITC-CD8a、抗 PE-H2Kb 均购自商业公 司。药物及试剂的配制及使用按说明书 进行。 1.4 宫颈癌负瘤小鼠模型的建立 及免疫治疗方案 1.4.1 实验动物 选用健康近交系 C57BL/6 小鼠，5 周龄，雌性，体重 2030 g，购自北京维通利华动物技术 有限公司，合格证号：SCXK（京） 2016-0011。按三级动物要求，饲养在 无特定病原体环境中，所用饲料、饮水 及垫料均经高压灭菌处理。 1.4.2 动物实验分组及用药方案 于小鼠左侧下腹部皮下注射 1105 TC-1 细胞建立宫颈癌模型，负瘤第 5 天，小 鼠下腹部肿瘤大小约 0.5 cm。应用随机 数字表法将小鼠分为四组（每组 10 只） -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 ：HPV16E7-DNA 组、SAHA 组、 SAHA 联合 HPV16E7-DNA 组、对照组。 用药方案：HPV16E7-DNA 组给予 DNA 疫苗 5 g/kg；SAHA 组给予 SAHA 20 mg/kg；SAHA 联合 HPV16E7-DNA 组 给予 DNA 疫苗 5 g/kg+SAHA 20 mg/kg；对照组给予磷酸盐缓冲溶液 （PBS）100 L 。每 3 天 1 次，共 4 次。 用药途径：DNA 疫苗给予肌内注射； SAHA 与 PBS 给予腹腔注射。 1.5 测量肿瘤生长情况 自负瘤第 5 天开始，每 3 天测量 肿瘤的最长径（a ）和最短径（ b）至免 疫治疗结束第 8 天，按 ab2/2 公式计算 肿瘤体积，取各组平均值。 1.6 流式细胞仪检测小鼠外周血 HPV16E7 特异性 CD8+T 细胞的数量 治结束第 8 天取小鼠尾静脉 血，裂解红细胞，制备单细胞悬液，加 入抗 PE-HPV16-E7 四聚体 0.5 L（0.1 g）与 FITC-CD8a 1 L（ 0.2 g） ，4 孵育 30 min，流式细胞仪检测 HPV16- -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 E7 四聚体阳性的 CD8+T 细胞数量， FlowJo 软件进行数据分析。 1.7 流式细胞仪检测 SAHA 对 TC-1 细胞 MHC1 类分子表达的影响 将 TC-1 细胞悬液转移至 6 孔平 板，细胞浓度为 2105/孔，高剂量 SAHA 组（25.0 nmol/L） ，低剂量 SAHA 组（12.5 nmol/L） ，对照组 （PBS） ，37培养 24 h。收集细胞，制 成单细胞悬液，加入抗 PE-H-2Kb 0.5 L（0.1 g） ，4孵育 30 min，流式细 胞仪检测各组 TC-1 细胞 MHC1 类分子 H-2Kb 的表达，FlowJo 软件进行数据分 析。 1.8 统计学方法 采用 SPSS 22.0 软件包进行数据 分析，计量资料以均数标准差（xs） 表示，多组间的比较采用 ANOVA 方差 分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验， 以 P 0.05） 。见表 1。 2.2 各组小鼠外周血 HPV16E7 特异性 CD8+T 细胞数量比较 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 与对照组、HPV16E7-DNA 组和 SAHA 组比较，SAHA 联合 HPV16E7- DNA 组的小鼠外周血 HPV16E7 特异性 CD8+T 细胞数量明显增高，差异有统 计学意义（P 0.05） 。见图 12。 2.3 SAHA 对 TC-1 细胞 MHC1 类分子 H-2Kb 表达的影响 c 对照组比较，SAHA 组细胞 MHC类 分子 H-2Kb 的表达明显增高，差异有统 计学意义（P 0.05） 。见图 3。 3 讨论 目前中国每年宫颈癌的新发病例 约 13 万，发病率居世界第二，严重威 胁女性健康5。以 HR-HPV-E7 为靶点 研发 DNA 疫苗，对宫颈癌进行免疫治 疗，为该类疾病的防治开辟新的途径。 DNA 疫苗性质稳定，无 MHC 限制性， 可制成多价疫苗，用于治疗多型别 HPV 感染的宫颈癌。但 DNA 疫苗的免疫原 性弱，而宫颈癌患者的免疫系统处于抑 制状态，不能诱发机体产生理想的免疫 应答6。近年来，学者们通过不同的途 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 径，试图增强 HPV-DNA 疫苗的免疫原 性7-8 。 宫颈癌细胞 MHC类分子表达 下降或缺失，使肿瘤细胞不能为 CD8+T 细胞识别并杀伤，造成免疫逃 逸9；HR-HPV 病毒本身也能逃避宿主 免疫系统的攻击而不被清除10-11。因 此，提高宫颈癌细胞 MHC类分子的 表达是宫颈癌免疫治疗的重要策略。 HDACI 类药物 SAHA，通过抑制肿瘤 细胞增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤血管生 成及转移、降低肿瘤侵袭力等机制发挥 抗肿瘤作用12 。研究表明，SAHA 与 DNA 疫苗联合应用，通过增加 DNA 疫 苗编码蛋白质的表达，上调 MHC 分子 的表达，从而产生免疫治疗效应13-17。 本研究结果显示，SAHA 能提高宫颈癌 细胞 MHC类分子 H-2Kb 的表达；而 在低剂量与高剂量 SAHA 组之间比较， 宫颈癌细胞 MHC类分子表达的差异 无统计学意义。低剂量 SAHA 即可上调 肿瘤细胞