高压氧治疗对大鼠创伤性脑损伤后nogo―a及ngr表达的影响

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 高压氧治疗对大鼠创伤性脑损伤后 NogoA 及 NgR 表达的影响 摘要目的 探讨高压氧治疗对大 鼠创伤性脑损伤后 Nogo-A 及 NgR 表达 的影响。方法 选取 SPF 级 SD 大鼠 100 只，利用 Feeney 自由落体撞击法制成 急性中度创伤性脑损伤模型，将模型随 机分为治疗组（n=20）和损伤组 （n=80） 。损伤组不做特殊处理、治疗 组建模成功后进行高压氧治疗。观察两 组大鼠创伤后第 1、3、5、7、10 天时 间段内大鼠脑内 Nogo-A 及 NgR 的表达 差异。结果 治疗组、损伤组大鼠均在 创伤后第 3 天的 Nogo-A 及 NgR 表达最 高，治疗组大鼠的 Nogo-A 及 NgR 的表 达在创伤后第 1、3、5、7、10 天的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 Nogo-A 及 NgR 表达均低于损伤组，差 异均有统计学意义（P 中国论文网 /6/view-13007973.htm 关键词 高压氧治疗；创伤性脑 损伤；Nogo-A 及 NgR 表达；大鼠 中图分类号 R749.16 文献标识 码 A 文章编号 1674-4721（2017） 11（c）-0007-03 Influence of hyperbaric oxygen therapy on the expression of Nogo-A and NgR after traumatic brain injury in rats TU Yao-ran NIU Fan HONG De- quan HU Yong Trauma Center，Third Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330008，China AbstractObjective To investigate the influence of hyperbaric oxygen therapy on the expression of Nogo-A and NgR after traumatic brain injury in rats.Methods One hundred SD rats （SPF grade） were selected and established as acute -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 moderate traumatic brain injury models using Feeneys method.The models were randomly divided into treatment group （n=20） and injury group （n=80）.In the injury group，no special treatment was applied，while in the treatment group， hyperbaric oxygen was adopted after successful modeling.The differences in the expression of Nogo-A and NgR in rats 1， 3，5 ，7 and 10 days after the trauma of rats in two groups were observed.Results The expression of Nogo- A and NgR were highest in the third day after trauma in both the treatment and injury groups.The Nogo-A and NgR expression in the treatment group were all lower than those in the injury group 1，3，5，7 and 10 days after the trauma，and the differences were statistically significant （P0.01）. Conclusion Down-regulation of Nogo-A and NgR expression by hyperbaric oxygen -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 is one of the mechanisms of promoting central nerve regeneration. Key wordsHyperbaric oxygen therapy；Traumatic brain injury；Nogo- A and NgR expression；Rats 中猩窬 系统内神经轴突生长 抑制因子-A（neurite outgrowth inhibitor- A，Nogo-A）与其受体（nogo receptor，NgR）结合后可抑制轴突生长， 主要通过激活细胞内炎症信号核转录因 子 B（ nuclear factor-kappa B，NF- B）通路引或改变胞内钙离子浓度实现 1。研究发现，运用高压氧治疗创伤性 脑损伤（TBI） ，可对神经系统功能有不 同程度的改善，但其机制并不明确2。 因此本研究考察高压氧治疗对大鼠中度 创伤性脑损伤后不同时间段脑内 Nogo- A 和 NgR 受体表达的影响，探讨高压 氧治疗对大鼠创伤性脑损伤后神经功能 的影响及创伤时间与 Nogo-A、NgR 表 达的相关性，现报道如下。 1 材料 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 1.1 实验动物 SPF 级 SD 大鼠 100 只，体重 （25030）g，2025室温下培养， 标准饲养、自由进食、进水，自然光照。 1.2 试剂 sABC 试剂盒，DAB 显色试剂盒， 兔抗 Nogo-A IgG，兔抗 NgR，以上试 剂均由武汉博士德生物工程有限公司提 供。 1.3 仪器 大型高压氧舱，由解放军九四医 院提供；动物饲养设备，手术器械，麻 醉药品，荧光显微镜，免疫荧光分析仪， Feeney 撞击装置，组织 ney 法，将撞击 杆头端至于骨窗内，保持撞击杆与地面 垂直，于 30 cm 高度处将 20 g 撞击锤释 放，冲击撞杆，撞击鼠脑。撞击完成后 迅速抬起撞击杆。若发生出血，用棉球 轻按至止血。清理术野，间断缝合切口。 先将大鼠转移至保暖垫上，待出现身体 活动后，再移回鼠笼。将模型随机分为 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 治疗组（n=20）和损伤组（n=80） ，损 伤组又随机分为创伤后第 1 天（n=16） 、 第 3 天（n=16） 、第 5 天（n=16） 、第 7 天（n=16）和第 10 天（n=16）5 个小 组。 1.4.2 高压氧治疗 建模成功后， 将治疗组大鼠放入高压氧治疗箱的高压 氧舱行高压氧治疗。 1.4.3 免疫组织化学检测 脑组 织切片制作：用 10%水合氯醛将大鼠过 量麻醉，确定大鼠无痛觉反应后，用室 温生理盐水和 4的 4%多聚甲醛行心 脏灌流。灌流完成后打开颅腔取下大脑， 运用锋利薄刀片切取大小约为 1 mm 的 脑组织，切片时注意切勿挤压与用力。 将所取脑组织浸入 3%戊二醛溶液中进 行固定。固定后用磷酸盐缓慢冲洗 3 次， 每次 10 min，缓慢冲洗后运用四氧化锇 进行再次固定 2 h，然后再次运用磷酸 盐缓慢冲洗 3 次，每次 10 min；后脱水， 在丙酮与包埋剂 1：1 的条件下进行浸 透，然后进行包埋聚合，运用硝酸铅与 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 醋酸铀染色，染色后裱于胶质包被的载 玻片上，烘干后于常温阴暗干燥处保存 备用。免疫组化测定大鼠创伤灶边缘 Nogo-A 及 NgR 蛋白：取所制脑组织切 片，运用二甲苯、乙醇脱蜡，在 3%双 氧水中孵育 15 min，蒸馏水冲洗 3 min；PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤 3 次， 每次 3 min。在高压热下进行抗原修复； 修复后再次 PBS 洗涤 3 次。配置并滴加 一抗 4050 l 置入 37烤箱内孵育 1 h，然后室温下放置 30 min 并 PBS 洗涤 3 次。滴加二抗，同样于 37烤箱内孵 育 1 h，再次 PBS 洗涤 3 次。BAB 显色， 自来水洗涤，脱水、封片。在普通显微 镜下观察结果，利用荧光显微镜成像摄 片，用 Image J 软件将结果量化。 1.5 统计学方法 采用 SPSS 18.0 统计学软件进行 数据分析，计量资料用均数标准差 （xs）表示，两组间比较采用 t 检验， 以 P0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 2.1 两组大鼠创伤灶边缘不同时 间段 Nogo-A 表达的比较 在创伤后第 3 天，两组大鼠脑内 Nogo-A 表达最高，治疗组大鼠的 Nogo-A 表达在创伤后第 1、3、5、7、10 天均明显低于损伤组， 差异有统计学意义（P0.01） （表 1） 。 2.2 两组大鼠创伤灶边缘不同时 间段 NgR 表达的比较 创伤后第 3 天，两组大鼠脑内 NgR 表达最高，治疗组大鼠在创伤后第 1、3、5、7、10 天的脑内 NgR 表达均 明显低于损伤组，差异有统计学意义 （P0.01） （表 2） 。 3 讨论 Nogo-A 蛋白是存在于髓鞘中的 一种轴突再生抑制因子3。研究证明， Nogo 蛋白的编码基因为 nogo，属于网 状蛋白质家族，主要分布于中枢神经系 统少突胶质细胞内。Nogo-A 由 1 个 Nogo 蛋白共有的 188 个氨基酸羧基末 端以及 2 个跨膜结构域和一个巨大的氨 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 基末端组成。Nogo-A 具有 2 个抑制性 功能结构域，一个是跨膜环状 Nogo- 66，位于细胞，另一个是较长的氨基端 区（amino-Nogo） ，定位于胞质内4-5。 NgR 是 Nogo-A 的特异性受体， 广泛分布于中枢神经系统中，在灰质中 含量最高6-7。NgR 由 1 个肽信号、8 个富含亮氨酸的重复序列、1 个富含半 胱氨酸的重复序列羧基端和 1 个糖基磷 脂酰肌醇偶联跨膜区组成8。 多种造模研究发现，Nogo-A 抗 体或 NgR 拮抗剂后，可明显下调 Nogo- A 和 NgR 的表达，可促使中枢神经轴 突再生，对神经功能恢复有重要意义9- 10。研究表明，成年恒河猴单侧颈髓 损伤后运用 Nogo-A 抗体可明显使其运 动功能得到恢复。也有研究证明， Nogo-66 拮抗剂可治疗大鼠脊髓损伤， 促进大鼠中枢神经轴突生长，恢复大鼠 功能。此外，还有相关实验证明，运用 NgR 疫苗法，使大鼠体内产生 NgR 抗 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 体，可对受损的中枢神经其明显恢复作 用11-13。大量实验表明，在创伤性脑 损伤中，Nogo-A 及 NgR 的异常表达贯 穿整个过程14 。 随着科技发展，高压氧疗法已被 广泛运用与脑外伤治疗中，且受广大学 者关注，因其疗效明确，目前已成为脑 外伤后重要的辅助治疗手段15。本研 究中，运用高压氧对脑损伤后大鼠进行 治疗，明显降低了大鼠脑内 Nogo-A 及 Ng