中医对高脂血症及动脉粥样硬化性疾病的认识及其整体调节中国中医研究院基础所宋剑南教授课件

中医对高脂血症及动脉粥样硬化性 疾病的认识及其整体调节 中国中医研究院基础所 宋剑南 2005.8.15 中医对高脂血症及动脉粥样硬化的认识 脾不健运 高梁厚味 气 痰 证瘀 证痰瘀兼证 气机不畅 气虚血瘀血 脂蛋白代谢紊乱 TC. TG. LDL升高 脂质浸润，凝血纤溶系统改变，血粘度 增高，血小板活化，内皮损伤，炎症 血栓形成 血管壁细胞增生 粥样斑块 舌质暗紫 或有瘀点瘀斑 苔白腻 异病同证、同病异证相互关系及外延因素模式简图 年龄、环境、情志等内外因素 高 脂 血 症As As是本虚标实之症，脏腑气虚为本，痰 、瘀、毒为标。 痰 是机体物质代谢过程失控生成并过量积 累的各种病理性产物，且可在一定条件下转化 成新的致病因素的那些物质的总称。 瘀 是病理性生化物质的物理化学性质和生 物学功能发生改变或同时有相关细胞形态结构 和功能改变的结果，并可释放出炎性因子及自 由基等进一步促进痰向瘀的转变。 痰、瘀、气、毒的现代概念诠释 气 脏腑之气是脏腑功能的表达形式， 具有调节控制物质代谢过程的功能。是生痰 和由痰致瘀的调节枢纽，气虚和气滞是病理 产物之痰转变成致病因子之痰的关键和主要 限速因素。体内自由基的积累和由此引起的 一系列连锁反应可能是气虚、气滞的最直接 体现。 毒 内生之毒可能是体内脏腑功能失调造成排泄不 畅而留滞体内的某些废物对细胞、组织、器官等能 产生毒害效应的物质，其物质基础包括各种自由基 和由其激活形成的一系列产物或中间体以及炎性因 子等，它们除直接的细胞毒作用外，尚可导致其他 生物大分子或代谢物发生结构功能改变而成为致病 因子或产生细胞毒害作用，其中以蛋白质、脂类及 多糖等的氧化修饰最为典型，这些结构功能改变的 生物大分子可能是证候发生及传变的主要分子基础 。 痰 （致病因子） 毒 痰 （病理产物） 运化 脏腑功能失调 虚 滞 逆 气机 瘀 脉络 中医证候的概念和特征 证候是通过四诊(即望、闻、问、切）手 段获取的机体在某一时空条件下对各种内外因 素（包括机体生理功能及生物、化学、环境、 精神、气候等各种致病因子）反应而呈现的生 理、病理状态信息的综合判断的表述。 证候的基本概念 证候的特征 整体性 天人合一，是对多因素的整体综合。 追求阴阳平衡与协调。 时空性 随时间、状态、环境等因素发生变化， 是机体即时性功能状态的反映，即具 有动态的概念。 传变性 相关证型间可以相互影响，并按照 一定规律发生传变，表明可证候复 杂的相互关系。 个体差异性 一病多证，一证多病，体现了机体 先天禀赋及功能状态对各种环境、 精神因素等的反应性，是其多样性 的基础。 证候的本质具有复杂的相互关系和多样性以 及开放式多维网络特征，属于复杂性科学系统。 因此要从整体观出发，采用系统生物学理论，在 整体细胞生物学水平上，借助细胞生物学、分子 免疫学、生物化学、分子生物学等技术，并结合 化学、物理学、数学、信息学、天文学、气象学 、自然及经济地理学、生态学、心理学、社会学 、考古学、人口学以及哲学、经济学、历史学、 语言学等学科中相关的方法和成果，进行全方位 的多学科联合攻关。 影响证候发生、发展的因素 先天禀赋 禀赋差异是个体差异的决定性因素，禀赋 的不同是脏腑功能、证候易感性和变化的 趋向性差异的内因，决定着机体对外环境 的适应能力和反应性，是同病异证，异病 同证形成的根本原因。 环境因素 包括自然环境（即地理、气候环境）、生 态环境、生活及工作环境、社会环境、人 文环境等。 精神因素 心理、精神、情绪等。 自我调养 生活习惯、饮食、嗜好、行为、劳 逸调节、个人修养。 先天禀赋、体质、证候的关系 先天禀赋 是于生俱来的，是存在于个体内的 全部来自父母的遗传物质，决定每 一个体的体质和精神类型，除特殊 环境因素外，一般终生不变，属于 潜在的结构态或稳定态。 体质 是人群及人群中的个体在遗传的基础上，在环境 影响下，在其生长发育和衰老的过程中形成的代 谢、机能等结构相对稳定的特殊状态。体现了先 天与后天两层含义，因此，体质是遗传信息转 录、翻译后生物体表达的性状，即个体的体质是 先天禀赋的转录结果，与后天环境有密切关系， 是形神合一和精、气、神的集约式，体质属于机 体的功能态，因此是可变的。 证候 是体质在特定条件下的表达形式，是 机体的一种反应状态（简称反应态）， 体质状态决定了证候产生的必然性。 三者代表了机体的不同功能状态 不可改变 结构基因组 （DNA） 表 达 蛋白质组 （protein） 功能基因组 （mRNA) 转 录 结构态 功能态 反应态 先天禀赋 体 质 （精气神） 转 录 （形） 表 达 证 候 不可改变 有 针 对 性 调 控 体质类型及后天摄养对冠心病 及其证候发生的影响 CHD与体质类型的关系 CHD患者体质类型与基因多态性的关系 冠心病的几种主要的体质类型均与 可引起脂质代谢紊乱的基因多态性（包 括apoE第四外显子4,IE1 G和LDL-R外 显子13AvaII位点的+）具有密切关联。 CHD患者apoE及LDL-R基因多态性的关系 ApoE基因型及等位基因分布 组 别 n 基因型 等位基因 3/3 4/43/42/3 2/2 2/4 2 34 对 照 100 0.660 （66） 0.020 （2） 0.140 （14） 0.170 （17 ） 0.000 （0） 0.010 （1） 0.090 （18 ） 0.815 （163 ） 0.095 （ 19） 病 例 2000.490* （98） 0.025 （5） 0.335* （67） 0.140 （28 ） 0.005 （1） 0.005 （1） 0.077 （31 ） 0.728 (291) 0.195* （78） ApoE IE1 基因型及等位基因分布 组 别 n 基因型 等位基因 G/GG/CC/CGC 对 照 100 0.370 (37) 0.450 (45) 0.180 (18) 0.5950.405 病 例 200 0.560* (112) 0.380 (76) 0.060 (12) 0.7500.250 LDL-R 基因型及等位基因分布 组 别 n 基因型 等位基因 +/+ -/+ -/- + - 对 照 1000.070（7） 0.290（29） 0.640（64） 0.215 0.785 病 例 200 0.080（16 ） 0.420 (83)*0.510(101)0.288 0.713 apoE及LDL-R基因多态性对CHD 患者血脂水平的影响 不同等位基因携带者血脂水平比较 （mmol/L） 组别 n TC TG HDL-C LDL-C AI E2/2 E2/3 E3/3 127 4.181.13 1.531.05 1.160.46 2.360.93 2.401.40 E2/4 E3/4 E4/4 73 4.901.25* 2.172.45* 1.090.42 2.901.00* 3.001.50* P 0.0001 0.0316 0.2956 0.001 0.0015 ApoE IE1基因多态性对血脂水平的影响（mmol/L） C/C (12)G/C (76)G/G (112)P1P2 TC4.271.284.451.274.681.160.1617 0.1403 TG1.660.991.761.801.932.370.68520.5665 HDL-C1.190.531.140.401.070.390.36210.3591 LDL-C2.470.992.480.97 2.741.01 0.18650.2009 AI2.580.842.911.603.381.010.08380.0769 LDL-R基因多态性对血脂水平的影响 （mmol/L） +/+(16) -/+ (83) -/-(101) TC 4.681.24* 4.231.20 4.091.17 TG 1.832.00 1.701.22 1.450.71 HDL-C 1.150.43 1.080.42 1.320.79 LDL-C 2.661.04 2.480.86 2.151.08 AI 3.081.03 2.880.73 2.170.86 对TC水平的影响 对TG水平的影响 对HDL-C水平的影响 对LDL-C水平的影响 ApoE第四外显子和IE1联合基因型对血脂水平的影响 ApoE第四外显子和LDL-R联合基因型对血脂水平的影响 同样采用广义线性回归模型，把性别、年龄、 BMI作为协变量，进行基因型联合作用下的TG 、TC、HDL-C以及LDL-C均值之间的比较，未 见显著性差异。联合基因型对冠心病患者血脂水 平的影响需扩大样本量进行进一步研究。由此也 可以初步推断，这两种基因多态性可能是通过各 自独立的机制对血脂水平和冠心病的发病产生影 响。 体质类型与基因多态性的关系 瘀血质与基因型关联性分析阳性结果 所选变量P值OR及CI（95%） 瘀血质（主兼）， apoE基因型E3/4 0.00956.0000， 1.3682，26.3112 瘀血质（主）， apoE基因型E3/4 0.00732.6010， 1.0345，6.5394 瘀血质（主）， apoE等位基因4 0.02707.6364， 1.7582，33.1668 瘀血质（主）， IE1等位基因G 0.03876.9688， 1.5862，9.3554 瘀血质（兼）， LDL-R基因型+/+ 0.04053.7011， 0.9833，13.9313 痰湿质与基因型、等位基因关联性分析阳性结果 所选变量 P值OR及CI（95%） 痰湿质（主），apoE基因型E3/4 0.04472.0755，1.0106，4.2625 痰湿质（主兼），IE1基因型G/G 0.03284.5801，1.0986，7.6859 痰湿质（主），LDL-R等位基因+ 0.03273.5034，1.5431，5.8324 气虚质与基因型、等位基因关联性分析阳性结果 所选变量P值OR及CI（95%） 气虚质（兼），apoE基因型E4/40.03068.0000，0.8763，73.0309 气虚质（兼）,apoE等位基因40.04651.8760，1.0329，304071 气虚质（兼），IE1基因型G/G0.02897.5219，2.5633，10.6581 湿热质与基因型、等位基因关联性分析结果 所选变量 P值OR及CI（95%） 湿热质（主）， apoE基因型E4/4 0.000140.2857 5.7790，280.8319 湿热质（主兼） ， LDL-R (-)等位基因 0.01134.4654， 1.2792，15.5883 体质类型对证候产生的影响 非痰非瘀证 瘀证痰瘀互阻证痰证 P值 OR值 P值 OR值 P值 OR值 P值 OR值 主 兼 体 质 痰湿质0.00015.08440.000116.3125 瘀血质0.00017.1530 阳虚质0.00993.79400.00462.6100 阴虚质0.00217.1329 湿热质0.02243.0784 主 体 质 痰湿质0.0097 2.67680.000111.5143 瘀血质0.00015.3333 阳虚质0.0001 11.6308 阴虚质0.0001 21.1905 兼 体 质 湿热质0.03985.0424 痰湿质0.00013.7572 阳虚质0.0001 6.2857 气虚质0.0001 12.56720.01724.56670.00849.67810.00018.5029 湿热质 0.0202 5.8621 痰证与痰湿质关联 瘀证与瘀血质、阳虚质关联 痰瘀互阻证与痰湿质和湿热质相关联 非痰非瘀证与阴虚质、阳虚质相关 四种证候均与气虚质相关 痰湿质有促进三种证候的倾向，系数相近； 瘀血质促进瘀证，但对痰证的影响较小； 气虚质与痰证、痰瘀互阻证和瘀证关系都很密切 ； 阳虚质对瘀证影响较大 不同证候的血脂水平 环境、后天等因素对CHD证候形成的影响 瘀证痰瘀互阻证痰证 肉酒烟嗜好 0.1308 0.1550 0.4811 少运动 0.1258 0.2116 0.4957 几乎不运动 0.0195 0.1588 0.1618 嘈杂环境 0.1248-0.0300-0.0936 常运动-0.2987-0.2200-0.2031 年龄-0.1173-0.1012 -0.1083 性别 0.0867 0.2915 0.1696 职业 脑力 0.1167 0.1568 0.2188 职业 体力-0.1582 -0.0638-0.1156 肉酒烟嗜好有加重痰证的倾向，痰瘀互阻证次 之，瘀证再次之。 几乎不运动或少运动有促使痰证和痰瘀互阻证 的倾向，而经常运动对三种证候有抑制作用。 嘈杂的生活环境对瘀证的影响较强。 BMI对痰证和痰瘀互阻证的影响大于瘀证 。 脑力劳动对痰瘀互阻证和痰证的影响大于瘀证 。 多态性与证候 E2/2-0.00940.08200.0551 E2/30.08490.05420.0110 E2/4-0.04070.06540.0458 E3/30.0403-0.1184-0.2703 E3/40.11010.22870.2568 E4/40.02240.11680.1217 IE1 G/G0.06590.10260.1261 IE1 C/C-0.1393-0.1125-0.2953 IE1 G/C0.05630.05300.0782 LDL-R -/-0.03290.0256-0.0040 LDL-R +/+0.0138-0.03240.0439 LDL-R -/+0.1311-0.01140.0871 BMI0.08240.18250.3184 瘀证痰瘀互阻证痰证 apoE E3/4、E4/4基因型、IE1G/G基因型对痰 证，痰瘀互阻证的影响大于瘀证，而LDL-R外 显子13的+/-基因型对瘀证影响较大。 高脂血症及动脉粥样硬化不同 证候的蛋白质组学研究 我们推测，高脂血症及As不同痰瘀证侯 在蛋白质组水平上可能存在某些功能蛋白种 类和表达量的显著差异性，痰瘀间可能存在 某些标志性蛋白种类上的兼容性，由痰致瘀 变化过程中存在某些关键蛋白的结构性或功 能性变化。 血脂测定 中医辨证 痰证/瘀证/痰瘀兼证 纳入病例 血 样 血液流变颈动脉B超 西医病理表型 问卷调查四诊资料 预选病人 高脂血症/As 数 据 录 入 相 关 性 分 析 数学模型研究 血浆和血小板 蛋白组学分析 功能蛋白质的结构和性质鉴定 技术路线 正 常痰瘀互阻证瘀 证 不同痰瘀证候高脂血症及动脉粥样硬化病人血浆 2-DE凝胶电泳结果，图中圆圈部分显示具有蛋白质表达差异 2-D凝胶电泳分析结果 利用Amersham公司的2-DE-PAGE分析软件对血 浆双向电泳结果进行分析，获得可识别蛋白斑点分 别为：正常635，血瘀证657，痰瘀互阻证662。 正常平均胶中的431个点可与来自血瘀证和痰瘀互 阻证平均胶中的点发生匹配。 与两种证候均匹配的点为194个，其中37个点呈由 正常血瘀证痰瘀互阻证呈递增趋势，23个 点呈递减趋势。 SELDI 蛋白质芯片技术 Ciphergen ProteinChip Systems and Arrays 蛋白质飞行质谱仪和芯片 生物芯片 化学芯片 疏水芯片 阳离子交换金属芯片亲水芯片 PS10 or PS20 抗原- 抗体 受体 配体 DNA - Protein 阴离子交换 ProteinChip Arrays 蛋白质飞行质谱芯片种类 *SELDI: Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Protein Capture: 蛋白质的捕捉 Sample is placed on a ProteinChip Array and processed. Sample proteins bind to chemical or biological “docking sites” Non-binding proteins are washed away, eliminating sample “noise”. WASH ProteinChip Technology: SELDI TOF-MS 蛋白质飞行时间质谱技术: 质谱仪 Retained proteins are “eluted” from the ProteinChip Array by Laser Desorption/Ionization Ionized proteins are detected and their mass is accurately determined by Time-of-Flight Mass Spectrometry Intensity Molecular Mass (Da) DetectorDetector Laser TOF-MS 标 志 蛋 白 痰 瘀 证 候 蛋 白 质 组 学 研 究 采用阴离子交 换柱样品分离 蛋 白 遴 选 血样处理 采用H4、IMAC-3、 WCX2等不同化学修饰 表面的蛋白质芯片捕 获样本中不同类型的 蛋白质 采用Biomarker Wizard 和Biomarker Pattern 软件分析蛋白质图谱， 建立不同证候的标志分 子模型 比较不同样品的图 谱，分析不同痰瘀 证候蛋白组学的差 异 蛋白质芯片分析结果 经对89例高脂血症及动脉粥样硬化痰、瘀 、痰瘀互阻和非痰非瘀病人（另有15例正常对 照）血浆样品的分析获得如下结果： 正常对照与病人之间存在极明显的差异，差异蛋 白荷质比（M/Z）至少包括9448、8945、8623、 8148、4475等蛋白峰，其中9442、8936、8623属 于差异极明显，在病人中表现为明显上调，而 8623则在正常人的血浆中则几乎无表达，这些蛋 白峰有可能作为高血脂症及动脉粥样硬化病人的 蛋白质标志分子。 痰瘀互阻证 瘀 证 痰 证 非痰非瘀证 小结：该蛋白的变化趋势可能与由痰致 瘀的证候变化规律密切相关，是本项研究的一 个十分重要的发现。 在痰证、瘀证和痰瘀互阻证病人中发现了另 一个荷质比为13886的蛋白质，其表达量明显 高于非痰非瘀证病人，但在现有结果中尚不 能明确判断在三种痰、瘀证候中是否有明显 差异，其变化趋势也有待进一步分析研究。 结 论 为“不同证候之间在蛋白质组水平上存在