分子生物学常用技术.ppt

目 录 第二十二章第二十二章 常用分子生物学技术 的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application 目 录 第 一 节 分子杂交与印迹技术 Molecular Hybridization & Blotting Technology 目 录 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链 分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理 目 录 复性 RNADNA 目 录 （一）印迹技术 （二）探针技术 探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标 标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸 ，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是 否有同源的核酸分子存在。 目 录 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体 的分析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 目 录 Western BlottingWestern Blotting方法一方法一 n直接法： 优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非 特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵 目 录 Western BlottingWestern Blotting方法二方法二 n间接法： 优点： 1.信号放大， 2.灵敏度高（多个二抗结合 位点） 3.多种标记的二抗可供选择 4.免疫特异性不受标记影响 5.可选择不同的Marker 缺点： 1.有交叉反应引起的非特异 性条带 2.额外的二抗孵育以及条件 优化 目 录 Y Y HRP HRP HRP SuperSignal 底物与二抗HRP反应发光 5 SuperSignal HRP标记二抗与一抗蛋白复 合物结合 4 2 漂洗和封闭 1 电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上 3 一抗与蛋白结合 (小鼠单抗 或兔多抗) 间接间接Western BlottingWestern Blotting操作流程操作流程: : 目 录 其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip) 目 录 第 二 节 聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reaction 5 Primer 1 5 Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5 5 5 5 5 5 Template DNA 5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理 目 录 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。 目 录 目 录 n模板DNA n 特异性引物 n耐热DNA聚合酶 n dNTPs n Mg2+ 二、PCR体系基本组成成分 目 录 三、PCR的基本反应步骤 变性 95C 延伸 72C 退火 Tm-5C 目 录 （一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 四、PCR的主要用途 目 录 三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 实时PCR技术原理 目 录 目 录 三、DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA 序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四 种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反 应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后 ，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧 光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采 集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序 。 目 录 DNA自动测序结果举例 目 录 目 录 基 因 文 库 Gene Library 第 四 节 目 录 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library) 基因文库 (gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列 的克隆群体。 目 录 基因组 DNA文库 目 录 目 录 第 六 节 遗传修饰动物模型的建立 及应用 The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 目 录 转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子 宫，使之发育成个体。 转基因被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) 目的基因的受体动物 一、转基因技术 目 录 目 录 核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞 核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内 ，使之发育成个体，即克隆(clone)。 二、核转移技术 目 录 基因剔除技术 也称基因靶向(gene targeting)灭活， 有目的去除动物体内某种基因的技术。 三、基因剔除技术 目 录 四、基因转移和基因剔除技术在医 学中的应用 建立动物模型 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) 多基因决定疾病模型 目 录 第 七 节 生 物 芯 片 技 术 Biological Chip Technology 目 录 DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片 段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位 面积的支持物上 。 一、基因芯片 基因芯片(gene chip) 目 录目 录 目 录 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点 阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反 应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统 对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 二、蛋白质芯片 蛋白质芯片(protein chip) 目 录 第 八 节 蛋白质相互作用研究技术 Research Technology of Interaction of Protein 目 录 蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形 成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成 者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制 与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢 等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。 蛋白质之间相互作用研究的重要性 目 录 酵母双杂交 各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析