生态养殖法成功繁育濒危物种四眼斑水龟的研究.pptx

?四眼斑水龟(Sacaliaquadriocellata) 被国际自然保护联盟（IUCN）列为濒危物种，人 类对该 物种的需求日益增长，人工繁殖一直不成 功，其野生资源遭到持续破坏，种群数量急剧减 少，在很多区域已濒临灭绝 。在龟类资 源遭受严 重破坏的今天，龟类养殖被世界各国同行公认为 挽救濒危龟类惨遭灭绝最急迫也是最有效的方 法之一。以往对四眼斑水龟的人工驯养繁殖也有 过许多尝试，但均不成功。我们自 2007 年 1 月 至 2009 年 3 月，在饲养条件下通过改变饲养环 境、光周期、食物组成等，以生态养殖法和卵孵 化条件的严格控制，在饲养条件下连续两年繁殖 出两批共 8 只健康生长的幼体，首次成功突破了 四眼斑水龟在人工养殖条件下的繁育问题，为减 轻该物种野生种群的压力及人类对该 物种的可 持续利用提供了机会，也为其他濒危龟类的人工 驯养繁殖提供了范例。 关键词：四眼斑水龟；人工饲养；成功繁殖； 孵 化 ； 濒 危 物 种 .? 四 眼 斑 水 龟 (Sacaliaquadriocellata)为濒危物种（IUCN， 2006；赵尔宓,1998）。由于环境的严重破坏和因 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 宠物、食物及医药需求而导致的过渡猎捕，使得 四眼斑水龟野生种群数量急剧下降，在很多区域 已濒临灭绝 （ Debruial.,1999;LauShi,2000; 龚 世 平 等,2003）。 在龟类资 源遭受严重破坏的今天，龟类养殖 被世界各国同行公认为挽救龟类惨遭灭绝最急 迫也最有效的方法（Behler,1997;IUCN,1987）。 许多野生濒危的龟鳖类 物种已通过人工饲养繁 殖 成 功 地 实 现 了 种 的 保 护 （ SchleicherandLoehr,2001;Schleicher,2004 ;Symanski,2004;Beil,2005;DetlefandFritzsc he,2005）。对四眼斑水龟的人工饲养均以只能饲 养而不能繁育告终，无法缓解市场对野生种群的 需求，间接导致野外种群数下降（夏金 叶,1983;Rodel,1985;宋憬愚等,2002）。 四眼斑水龟人工的驯养繁殖的研究已有很 多尝试，但均不成功（周婷,1997；王志伟等， 2005）。主要原因是该物种生性胆小，在人工饲 养环境下难以满足其野生山涧溪流的独特生存 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 环境和食性，正常的行为受到严重抑制，始终处 于紧张和不适应的状态而无法正常生存和繁殖。 早期的死亡率高达 85%，主要是腐甲病、水肿病、 肠胃病等（王志伟等，2009），没有任何繁殖行 为的表现。 本课题组 （龟类研究兴趣小组）从 2004 年 到 2006 年曾经尝试 用激素诱导的方法克服其室 内繁殖障碍的难题，有效促进了繁殖行为的表 现，并产下 3 枚卵。但遗憾的是未能孵出幼体。 即便能够成功繁殖，人为注入外源激素的使用也 会使繁殖个体和其后代以及利用这些龟类产 品 的人类产生长期的负面影响。 实际上温度、光周期、降雨量、湿度和食物 供应等外界因子均可通过直接或者间接的途径 影响龟类的繁殖（Duvalletal.,1982）。光照等 环境因子可以直接引起生理变化和机体内在节 律的表达，从而影响龟类的繁殖；人工饲养条件 下频繁的人为干扰将明显胁迫龟类的正常繁殖； 只有当机体摄取的营养物达到身体所需的某一 临界值时其性腺才会正常发育以完成繁殖 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 （Kuchling,1998）。 为探究出一套适用性较强并易于付诸大规 模养殖推广的技术，满足人们对该 物种的大量需 求及减轻野生种群的压力，实现成功繁殖且保证 成功繁殖出的个体无外源激素污染的负面影响， 本课题主要利用即将被烹调的自宾馆饭 店抢救 来的四眼斑水龟，开展了一系列生态养殖法的研 究，取得显著成效。 1 材料与方法 参与实验的 56 只四眼斑水龟（30，26） 主要自海南岛琼中地区，已在本实验室饲养多 年。采用数字监控保安系统记录 个体发情求偶和 产卵等行为（Liuetal.,2008），运用全事件取样 法和瞬时扫描取样法观察记录行为（蒋志刚， 1999）。每月对雌性个体按照 Davidetal.(1998) 所描述方法进行超声波检测，记录卵泡发育情 况；并以 X 光投射法(Gibbonsetal.,1979)确定 硬壳卵的数量。卵泡个数统计公式：检测到卵泡 数（枚）=左右鼠蹊部检测卵泡数之和（包括闭 锁卵泡） 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 生态养殖池的建设面积为 33m2，且池内土 壤、石块、植被等均采自琼中湾岭地区四眼斑水 龟典型的野生环境。 1.1 减少胁迫试验 2007 年之前所有个体均混池饲养于 80cm 60cm 的水池中，饲养密度为 10 只/m2，饲养密度 过小将直接引起个体间频繁的冲突而影响雌性 正常繁殖，且频繁进出饲养室、日常的喂食换水 及测温度都将引起较为严 重人为胁迫。针对以上 问题： 2007 年 8 月至 2009 年 5 月将 24 只个体（12 ，12）饲养于室外以遮阳布处理且放置有四 眼斑水龟野外生境中的石头、植被等物，面积为 33m2 的池子（简称“生态池”）中，严格控制进 出生态池的频次，减少喂食换水和测温度的频 次。 1.2 补充食物营养试验 本实验室自 2002 年开始至 2006 年 12 月， 室内饲养四眼斑水龟以甲鱼 2 号饲料 1:1 混合自 来水，同时间断的每次投喂一种肉类或植物性食 物（水果和蔬菜）饲喂四眼斑水龟，发现其喜食 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 饲料和肉类，极少摄取植物性食物，这与其野外 以植物性食物为主相悖（史海涛等，2002），且 导致营养单一以致将威胁其健康。为提供更加丰 富的营养和合理膳食即采取以下途径：自 2007 年 2 月给予 8 只雌性个体采用绞碎机将 32 种食 物（包括：胡萝卜、香菜、瘦猪肉、西葫芦、椰 子菜、苦瓜、绿豆芽、白萝卜、空心菜、牛肝、 黄豆、西红柿、南瓜、茄子、菜花、红薯、菠菜、 生菜、鸡蛋、鱼、香菜、黄豆芽、芹菜、地瓜叶、 西瓜、黄瓜、大白菜、猪肝、玉米、韭菜、小白 菜、莴笋叶）绞碎成汁按照 1:1 配合混合饲料活 成面团进行投喂以丰富和补充个体所需营养，同 时根据各种食物的营养含量合理搭配（每次仅选 取其中 23 种食物投喂），每次所加食物均按照 等量配比后绞碎成汁与甲鱼 2 号饲料 1:1 混合。 食物种类均结合王志伟（2005）对饲养条件下四 眼斑水龟食性的研究结果选择四眼斑水龟喜食 食物。 1.3 光照影响性腺发育试验 四眼斑水龟饲养于室内多年但池内无自然 光照射，池内光强始终为零，表现为光周期不明 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 显，从而可能引起体内褪黑素（MLT）分泌增多 而抑制“下丘脑垂体性腺”轴的功能，使得 生殖激素的分泌减少而影响正常繁殖，为进一步 探究光周期等环境因子对四眼斑水龟繁殖的影 响，2008 年 10 月至 2009 年 3 月将 28 只四眼斑 水龟（14，14）均分为两个组：长日照组 （15L:9D）、短日照组（9L:15D）均给予自然光， 即在室外饲养，通过 UVB 灯管补光延长光周期， 三夹板封盖池口遮光以缩短光周期。 产卵率计算公式：产卵率（%）=产卵个体数 /实验个体数 1.4 雌雄混放试验 为获得更多的受精卵，本实验室于 2006 年 至 2009 年在每年的繁殖期将实验所用雌雄个体 适时地进行雌雄混放。具体操作如下：（1）2006 年 11 月至 12 月仅将用于激素实验的 13 只雌性 个体与雄性进行混放录像观察，共 6 次，每次混 放 24h；（2）2007 年 12 月将所有雌性个体分池 于雄性混放，并随机选池录像，共 6 次，每次混 放 24h；（3）2008 年 10 月至 2009 年 1 月将 8 只 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 雌性个体与 5 只雄性个体混放，共 11 次，每次 混放 96120h；同时其余个体自 10 月即一直于 雄性混养用于光照影响性腺发育试验。 1.5 孵化试验 2007 年 3 月至 7 月和 08 年 4 月至 8 月分别 对本实验室所产下的 4 枚和 8 枚受精卵进行孵 化 。 本 实 验 人 工 气 候 箱 （ 德 国 产 的 KBWF24001-22996 型）设置温度为 2427（2007 年控温在 2627，2008 年控温在 2425）， 箱内相对湿度控制为 90%。孵化用具为杉木箱 (37cm30cm20cm)和塑料盒(34cm22cm 11cm)，箱子和塑料盒上开有若干小孔，底部分 别垫一块纱布，卵底层放置 45cm 基质，卵表 面加 12cm 的基质。07 年以沙土为基质；08 年 控温组分别用沙土和蛭石作为基质，常温组为蛭 石。每天分 5 个时段（每隔 5 小时左右测量一次） 记录每组温湿度，同时根据基质失水情况适当的 在其表面洒水，以保持含水量。 孵化总积温计算公式：孵化总积温 (day)=孵化日平均温度孵化天数 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 1.6 数据处理 本文数据在 Excel（2003）和 SPSS（16.0） 中进行处理，所有实验数据均以 XS.D.表示。 2 检验两种喂食方案补充食物营养前后产卵率 差异显著性；非参数 Mann-WhitneyU 检验放入生 态池前后个体产卵数、长短光周期对卵泡发育和 产卵情况差异显著性。设置显著水平 =0.05， 极显著水平 =0.01。 2 结果与分析 2.1 改变饲养条件对繁殖的影响 饲养于生态池中的 12 只雌性个体仅 2 只在 放入生态池前产过卵，放入生态池中饲养后有 7 只个体产卵，对处理前后个体产卵数（未产卵个 体记为 0 枚）经 Mann-WhitneyU 检验知差异显著 （Z=-2.003,n=24,p=0.0450.05）。 2.2 补充食物营养对繁殖的影响 在室内单池饲养且按照改善后喂食方案饲 喂之前， 21 只雌性个体仅 5 只成功产卵；自 2007 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 年 2 月对 8 只个体按照改进的饲养方法喂养后， 2008 年和 2009 年均发现 8 只雌性个体中有 7 只 成功产卵，经 2 检验知处理前后产卵率差异极 显著（ 2=7.240,df=1,p=0.0070.01）。 2.3 光周期对性腺发育的影响 结合 2008 年 9 月到 2009 年2 月的 B 超检测， 可知：短日照组卵泡发育情况好于长日照，对每 月检测到卵泡数进行 Mann-WhitneyU 检验知两种 光周期下各个月份其卵泡数差异均不显著。对经 B超检测发现怀 有硬壳卵个体进行X光检测发现 ： 短日照有 3 只个体怀卵，共 6 枚；长日照仅 1 只 个体怀卵，共 2 枚。经 Mann-WhitneyU 检验知组 间产卵数差异不显著（p=0.2620.05）。 2008年11月至2009年2月的录像观察发现： 长日照组雄性个体有 4 只个体出现明显发情行 为，并有成功交配行为，行为占全天时间的 0.617 0.758%（n=6）；短日照组有 3 只个体出现发情 行为，占全天时间的 0.6160.731%（n=6）。将 两组个体的发情行为进行非参数 Mann-WhitneyU 检验，发现差异不显著（p=0.8680.05）。 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 2.4 雌雄混放对受精率的影响 结合试验处 理后次年产卵情况可知， 2007 年 有 5 只个体产卵（均来自混放的 13 只个体中）， 2 只产下受精卵；2008 年有 10 只个体产卵，4 只 产下受精卵；2009 年有 16 只个体产卵，8 只个 体产下受精卵。 2.5 孵化结果 2007 年和 2008 年分别对 4 枚和 8 枚受精卵 （图 2）孵化，各成功孵出 4 只四眼斑水龟幼体 （见图 3）。控制温度在 2427，平均孵化期 为 10711d（n=7,93119d），平均孵化总积温 为 2640.4191.7day（n=7，2390.1 2919.6day）。结合两年的数据可知：常温组 孵化率 33.3%（3 枚入孵，1 枚孵出），控温组孵 化率 77.8%（9 枚入孵，7 枚孵出），经 2 检验 知：不同组间孵化率表现为差异不显著（ 2=0.500,df=1,p=0.4800.05）；其中 07 年控温组 孵化率 100%（3 枚入孵，3 枚孵出，平均孵化期 为 964d），08 年控温组孵化率 66.7%（6 枚入 孵，4 枚孵出，平均孵化期为 1154d）。其中蛭 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 石组孵化率 20.0%（5 枚入孵，1 枚孵出），沙土 组孵化率 100%（7 枚入孵，7 枚孵出）。 3 讨论 3.1 减少人为胁迫对成功繁殖的作用 野生龟鳖类 从野外引入室内饲养会干扰正 常的生殖过程（KuchlingandBradshaw,1993）。 饲 养 条 件 下 ， 血 浆 性 激 素 浓 度 下 降 （Kuchling,1998）；应对饲 养胁迫，龟类会提高 皮质激素的浓度（TyrrellandCree,1998）。大量 的四眼斑水龟在饲养条件下表现出皮肤变薄，脂 肪向中性移动现象显示了其糖皮质激素分泌过 量。本实验所用个体，由于人为、环境和饲养密 度过小等作用造成胁迫，胁迫通过 HPA 轴（下丘 脑-垂体-肾上腺， hypothalamo-pituitary-adrenocortical），引 起肾上腺分泌肾上腺皮质酮增加。糖皮质激素的 分泌有利于个体克服胁迫，比如活动量增加以获 取足够的食物 （ Berdanier,1989;Boswelletal.,1994;Holber toal.,1996）。这就意味着四眼斑水龟处于胁迫 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 状态下。皮质酮的升高可能通过对性腺局部作用 或通过对下丘脑垂体轴的抑制，对性激素的合 成或释放起抑制作用（Paoluietal.,1990）。对 很多爬行动物的研究显示，糖皮质激素浓度的增 高限制了爬行动物睾丸功能。在蛇类 （Thamnophissirtalis）的研究中发现，注射外 源糖皮质激素抑制了该物种求偶交配行为的表 现（MooreandMason,2001）。基于以上推测，作 者认为饲 养条件下饲养胁迫导致雄性四眼斑水 龟生殖激素分泌不足，这在激素诱导雄性能立即 表达发情行为（Liuetal.,2008）得到验证。将 雌性置于生态池和室内单池饲养（尽量减小饲养 密度而减少干扰）后能正常成功繁殖。这些证据 证实了：不适应的环境导致性腺发育不良和激素 分泌量下降，最终导致繁殖障碍。 3.2 食物营养对成功繁殖的作用 通过对传统 喂食方案进行分析发现：四眼斑 水龟经常食用饲料及肉类食物，极少摄取植物性 食物（水果和蔬菜），直接导致营养过于单一， 同时打乱了其野外主要以植物性食物为主（史海 涛，2002）的食性规律。改善喂食方案后，食物 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 中的营养更加均衡，且更有利于个体吸收。 Kuchling(1998)研究表明在产卵前期和产卵期 丰富的食物营养供应是大多数龟类成功繁殖的 关键因子之一。营养充足供应引起相对较多的卵 泡募集发育，相反，营养不充足会导致卵泡在发 育过程中闭锁或者中止 （KuchlingandBradshaw,1993）。而本实验中自 2007 年 2 月改变喂食方案后，个体摄取营养物质 更加合理和丰富，从而在 2008 年和 2009 年分别 有 24 枚和 40 枚硬壳卵生成，这充分体现了营养 充足供应极其突出的作用。因此，丰富食物营养 也有利于实现成功繁殖。 3.3 光周期对四眼斑水龟繁殖的影响 结合 B 超检测结 果可知，短日照组对雌性卵 泡发育有促进作用，长日照组相对表现出一定的 抑制作用，这可能是由于四眼斑水龟属于短日照 动物。对于短日照动物，在短白昼期间高浓度的 褪黑素抑制促乳素释放，刺激 GnRH 和促性腺激 素释放增加，性腺活动增强，褪黑素表现为促进 繁殖的作用（朱士恩，2006）。长时间处 于长光 照条件下将导致光钝化而使长光照刺激 GnRH 和 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 促性腺激素释放作用减弱或者停止（张录强， 2000），因此长日照组出现相对的抑制作用。 相较于雌性而言，长日照对雄性的作用相对 短日照要明显。两组相对比：发情行为占全天时 间基本一致，但是长日照组出现明显的交配行为 且发情个体多于短日照组。造成雌雄差异的原因 可能是由于雄性性腺发育早于雌性（GanzhornD， 1983），即雌雄性腺发育机制不同。傅丽容等 （2007）报道雄性四眼斑水龟的精子发生期在夏 秋季节，冬季为精子发生停滞期。本次录像观察 到雄性发情强度均不够明显可能是因为实验 期 为雄性个体性腺发育的停滞期，光照作用还无法 表现，其中缘由有待进一步探究。 3.4 雌雄混放对成功繁殖的作用 交配刺激诱导排卵在很多哺乳动物中有所 报道（KauffmanandRissman，2006），近年来对 爬行动物的研究也发现交配可以刺激诱导雌性 个 体 成 功 排 卵 （ MendoncaandCrews,1989 ； Mathiesetal.,2004），其中 Manire 等（2008） 对蠵龟研究也发现交配有利于排卵并保证了一 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 定的受精率，而长时间 的雌雄混养保证了交配 率。研究表明当子宫颈因交配受到刺激后，通过 神经系统反射性地兴奋下丘脑垂体卵巢轴， 从而引起排卵（杨增明等，2005）。因此作者认 为保证长时间 的雌雄混养将有利于雌性个体体 内分泌足够性激素以补充因饲养胁迫而引起的 激素缺乏，从而保证更多的雌性个体正常繁殖； 同时混放时间和频次的增加将大大提高交配率， 直接保证受精率的提高。 3.5 孵化因子对孵化率的影响 温度是动物环境中的重要因素，孵化温度直 接影响卵生爬行动物的孵化率和孵化时间 （Packardetal，1987）。极端高温、低温导致胚 胎不能孵化或畸形率增加甚至死亡（Vinegar， 1974）。本实验中常温组在孵化后期温度较高（平 均温度达到 30），控温组温度始终相对较低（24 27），而常温组孵化率较低即由于孵化后期 温度过高而阻碍胚胎发育以致死亡，此结果与李 珊（2002）对乌龟 的报道一致。 卵生爬行动物卵的孵化期一般都随孵化温 父亲，把那个带有父亲生肖的吊坠戴在了她的脖子上，然后，提着行李离开了。那时 度 的 升 高 而 缩 短 (Molinaetal.,1998 ； Paezetal.,1998)，对比 07 年和 08 年控温组孵 化结果可以发现四眼斑水龟也符合这一结果。