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荧光原位杂交技术及产品简介 胡 斌 荧光原位杂交 （Fluorescence in situ hybridization ,FISH） FISH是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20 世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基 础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。靶 DNA与标记有荧光基团的探针同源互补，经变性-复 性，形成杂交体，洗脱未结合的探针，在荧光显微 镜下对杂交信号的大小、数目和分布等进行分析。 与荧光PCR的异同： 1. 都有探针，但FISH是杂交探针，荧光PCR是 Taqman 探针。 2. 都是检测核酸，但FISH保持了细胞的完整，荧光 PCR裂解细胞后再提取总DNA。 3. FISH直观判断单位细胞内信号数的多少；荧光 PCR通过机器扩增后判断拷贝数的多少。 4. 都通过荧光检测，FISH是荧光显微镜，荧光PCR 是 荧光PCR仪。 5. FISH的检测标本为石蜡切片，荧光PCR为血清、 组 织或细胞。 与其它常用技术比较： 1. FISH敏感性虽略低于PCR法，但其假阳性或假阴 性率却大大低于PCR法，特异性更好。 2. 与免疫组织化学法（IHC）相比，FISH具有良好的 稳定性和可重复性，检测信号更强。 FISH的优点： 1. 安全、快速 2. 灵敏度及特异性高 3. 探针能长期保存 4. 杂交信号强且能同时显示多种颜色 5. 信号数目可量化，为数字化病理诊断打下 基础 公司目前FISH产品情况： 1.膀胱癌CSP3/GSP P16基因检测试剂盒已取得受理 证号，今年6月左右可拿到注册证； 2.乳腺癌HER2（已报批，正开展后期临床实验验 证），今年4月可望拿到受理号； 3.前列腺癌TMPRSS2-ERG融合基因检测试剂盒（已 初步完成研发阶段，正准备报批程序）； 4.正在开展乳腺癌TOP2A，宫颈癌TERC，非小细胞 肺癌EGFR 等三个产品研发； 5.产前诊断试剂（21，13，18和性染色体）。 FISH实验的基本试剂： 1.荧光探针； 2.甲酰胺； 3.氯化钠； 4.柠檬酸钠； 5.氢氧化钠； 6.吐温20。 FISH实验的基本材料和设备： 1. 暗房； 2. 荧光显微镜（带成像系统）； 3. 恒温水浴锅； 4. 培养箱； 5. 染色缸； 6. 载玻片； 7. 移液器； 8. 暗盒。 实验方法及步骤 1）样品前处理 2）探针变性 3）标本变性 4）杂交 5）洗脱 6）封片 7）荧光显微镜观察 变性杂交 洗涤DAPI复染 50%甲酰胺 2XSSC 0.1%NP-40 70%乙醇 探针变性 标本变性 70%甲酰 胺 73C 5min 42C 湿盒 孵育过夜 FISH技术在乳腺癌检测中的应用 1. 检测的靶基因为Her-2: Her-2是乳腺癌细胞表面的受体，能控制癌细胞 的生长、浸润和转移，大约30%的乳腺癌病例表达 水平增加，其高表达阳性乳腺癌是一种高危肿瘤， 对常规的化疗反应性差，预后不好。 2. 赫赛汀治疗Her-2 高表达阳性乳腺癌： 赫赛汀为治疗性单抗，适用于治疗Her-2过度表达 的乳腺癌。 Her-2检测推荐方法 免疫组化（IHC） FISH 若IHC结果（），应由FISH证实 结果分析 正常细胞判断： 单个细胞红色及绿色信号各2个 异常细胞判断： 红信号大于2为异常细胞，但绿 色信号不少于2个。 结果判断 计数30个细胞，统计Ratio值（Ratio值30个细 胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数）： 1）Ratio1.8为阴性结果，提示该样本无Her-2基 因扩增； 2）Ratio2.2为阳性结果，提示样本中Her-2基因 发生扩增； 3）Ratio在1.8-2.2之间时，可以选择增加计数细 胞至100个,或重做FISH实验来判断最终结果。 HER-2/CSP 17 2.2（阳性结果） HER-2/CSP 17 2.2（阳性结果 ） HER-2/CSP 17 1.8（阴性结果） FISH技术在前列腺癌诊断中的应用 1.80%左右前列腺癌存在TMPRSS2与ETS基因家族的融 合改变； 2.TMPRSS2：21q22.2，为男性雄激素调节基因； 3.ETS家族为E26转化特异性基因，包括: ERG(21q22.3)、ETV1(7p21.2)、 ETV4(17q21) 4.FISH 检测TMPRSS2与ERG、ETV1、ETV4基因融合 成为前列腺癌早期诊断及预后判断的手段： TMPRSS2/ETV1融合，占比25% TMPRSS2/ERG融合，占比55% TMPRSS2/ETV4融合，占比2% FISH技术在膀胱癌诊断中的应用 FISH尿液检查 A. p16 缺失, 是移行上皮细胞肿瘤发生的早期事 件和关键步骤 B. 3, 7, 17 染色体的不稳定性与移行上皮细胞肿 瘤的浸润行为有关 C. 灵敏度( 大约 80%), 特异性 ( 大约 96%) p16（红色）、1