柠檬酸酒精综合实验.ppt

微生物发酵工程部分 柠檬酸产生菌的分离、发酵、分 析、提取及检测（好氧发酵部分） 酒精及酒类方面的综合实验 （厌氧发酵部分） 生物技术专业系统实验二生物技术专业系统实验二 生物技术专业系统实验二 （微生物发酵工程部分） 云南大学生命科学学院 生物技术系 张理珉 微生物发酵工程 u实验一 柠檬酸产生菌的分离及初筛 u实验二 柠檬酸产生菌的复筛 u实验三 应用正交实验法优选柠檬酸产生菌 u 的最佳发酵培养基 u实验四 柠檬酸产生菌的发酵 u实验五 柠檬酸的提取 u实验六 柠檬酸发酵产物及提取产品的检 u 测、鉴定 u微生物发酵工程是一门利用微生物科学和工程学 的原理去研究微生物在生物反应器中工艺特点和 生长规律的学科。主要研究微生物细胞中复杂的 生物化学反应，控制生物合成或降解、大规模地 生产预期的产物，达到特殊的目的。其应用范围 广泛，包括医药、食品、粮食、饲料、农业、林 业、化工、化纤、冶金、能源、环保等方面。 u微生物发酵工程实验是在学习了有机化学、微生 物学相关知识、微生物发酵工程中的工艺设备后 ，并具备一定的实验动手能力基础上，通过微生 物发酵工程实验课程的教学，使学生了解并掌握 微生物发酵工程中所涉及的发酵工艺、设备、分 析等几方面的知识及实验技能。 柠檬酸产生菌的分离、发酵、 分析、提取及检测（好氧发酵部分 ） 柠檬酸生产介绍 u 柠檬酸又名枸橼酸，它是存在于柠檬等水果 中的一种有机酸。学名为3-羟基3-羧基戊二酸。 u 柠檬酸具有令人愉快的酸味，它入口爽快， 无后酸味，安全无毒，是发酵法生产的最重要有 机酸。它在水中的溶解度极高，能被生物体直接 吸收代谢。它的许多特殊优点使它在各个工业部 门得到了广泛的应用。柠檬酸的盐类和衍生物也 各具优点，用途广泛，在国民经济中占有重要地 位。 u 本实验通以柠檬酸产生菌黑曲霉为代表，学 习工业微生物的分离、初筛、复筛、正交实验、 发酵罐发酵、产物提取及鉴定等实验，使学生较 全面系统地掌握微生物发酵工程的基本实验方法 和技能。 实验的总体路线 u土壤 稀释分离 变色圈平板 挑菌 纯化 摇瓶初筛 产 物鉴定 复筛 正交 实验 重复实验 发酵罐发酵 产物提取 产品鉴定 实验一 柠檬酸产生菌的分离及初筛 u实验目的： 1、了解黑曲霉菌在工业生产中的不同作用； 2、复习掌握从土壤中分离工业用微生物的原理 及方法； u3、掌握利用变色圈法筛选产酸菌的方法。 实验目的： 1、了解黑曲霉菌在工业生产中的不同作用； 2、复习掌握从土壤中分离工业用微生物的原 理及方法； 3、掌握利用变色圈法筛选产酸菌的方法。 实验原理： u1、新菌株的分离大致可分为采样、增殖（ 富集）培养，分离鉴定、性能测定等步骤 。 u2、柠檬酸可由曲霉菌发酵糖类而生成，其 中尤以黑曲霉产酸能力最强。目前工业生 产中多以黑曲霉为柠檬酸产生菌。 u3、黑曲霉耐酸性较强，在pH值1.6时仍能 良好生长。利用其产酸高、耐酸强的生理特 征，使用pH1.6的酸性营养滤纸分离该菌， 简单易行，再加上用变色圈法进行初筛，使 产柠檬酸的菌株更易被选出。 u4、黑曲霉产生的柠檬酸,可利用Deniges氏 液鉴别；其产酸量可用0.1N氢氧化钠滴定。 u1、土壤采样 u2、准备稀释分离用的器材 u3、将平皿、吸管包好后干热灭菌 u4、配制察氏培养基 u5、做成固体斜面 柠檬酸产生菌的分离实验步骤 : u6、配成蓝色的察氏-多民培养基 u7、湿热灭菌 u8、摆斜面、倒平板 u9、稀释土样 u10、涂布均匀 u11、倒置培养。 变色圈反应 u1、配制初筛发酵培养基并灭菌 u2、观察菌落 u3、挑选菌落变色圈，测量变色圈与菌落直径 之比，取比值较大者 u4、将选好的菌株编号，接入斜面。同时采用 倒置接种法在培养皿上点植接种 u5、培养斜面和平皿 u6、摇瓶发酵 u7、柠檬酸鉴定 u8、产酸量的测定。 柠檬酸产生菌的初筛实验步骤 : u1.简述从土壤中筛选产目的产物微 生物菌种的过程。 u2.土壤采样时应注意的哪些问题？ u3.黑曲霉柠檬酸产生菌菌株的富集 应考虑利用哪些特点来进行富集？ 思考题 实验二 柠檬酸产生菌 的复筛 实验目的： u1.掌握以初筛的菌株为基础进行选 优的复筛方法； u2.掌握摇瓶发酵的方法。 u初筛选出的菌株必须进行摇瓶发酵 复筛，复筛不是初筛简单的重复。 u复筛的主要目的： 考查菌株生产能力的自然波动范 围； 复筛的菌种经过斜面传代，在摇 瓶复筛中考查菌种的传代稳定性； 选出稳定、高产的菌株。 实验原理： u1. 将各菌种的孢子接种蔗糖培养 基中，同时作对照实验 u2.将实验组和对照组摇瓶振荡发酵 培养 u3.发酵结束后，测定并计算出空白 对照和各菌种的平均产酸率 u4.选取产酸率高且稳定的菌株 实验步骤 u1.为什么在平板初筛中有些菌落透 明圈或显色圈很大，但摇瓶发酵试 验结果产酸甚低？ u2.复筛中应该注意那些事项。 思考题 实验三 应用正交实验 法优选柠檬酸产生菌的 最佳发酵培养基 实验目的 u1.掌握利用正交实验优选最佳 发酵培养基的方法； u2.掌握极差法分析正交试验结 果的方法。 u正交设计是利用一套规格化的表格正交表，科 学合理地安排试验。这种设计的特点是在试验的 全部处理组合中，仅挑选部分有代表性的水平组 合进行试验。通过这部分试验了解全面试验情况 ，找到较优的水平组合。 u正交表是正交设计的基本工具。在正交设计中， 安排试验，分析结果，均在正交表上进行。 实验原理 u正交试验法：是利用正交表挑选出一部分 有代表性的试验，所以减少了试验次数， 另外用其进行整体设计，可以同时做一批 试验以缩短试验周期，用该法通过极差分 析、方差分析，还能告诉我们那些因素是 试验指标的主、次因素，因素间有交互作 用及交互作用的大小，分析出试验的误差 大小，对所做试验的误差大小等有个数量 的概念。 u1.确定试验因素和水平数 根据试验的目的确定 试验要研究的因素。为提高柠檬酸产生菌的产酸 率， 据资料查阅或经验，常用的柠檬酸发酵培 养基为：蔗糖15%，NH4NO30.2%，KH2PO4 0.1%，MgSO47H2O 0.25%。将其定为基础 发酵培养基，并以它确定了四个因素，每个因素 各三个水平，如下表所示 u2.选用合适的正交表 根据试验因素和水平数的 多少以及是否需要估计互作来选择合适的正交表 。如下表所示： 实验步骤 因素水平表 因素 水平 蔗糖（ %） NH4NO3 （%） KH2PO4 （%） MgSO47H2O （%） ABCD 1100.10.050.1 2150.20.10.25 3200.3020.5 L9(34)的正交表 列号 实验号 A（蔗糖） 1因素 B（ NH4NO3 ） 2因素 C（ KH2PO4 ） 3因素 D（MgSO4） 4因素 产酸率 （%） 11（10%）1（0.1%）1（0.05%）1（0.1%）X1 , X1 21 （10%）2（0.2%）2 （0.1%）2（0.25%）X2 , X2 31 （10%）3（0.3%）3 （0.3%）3（0.5%）X3 , X3 42 （15%）1（0.1%）2 （0.1%）3 （0.5%）X4 , X4 52 （15%）2 （0.2%）3 （0.3%）1 （0.1%）X5 , X5 62 （15%）3 （0.3%）1 （0.05%）2 （0.25%）X6 , X6 73 （20%）1（0.1%）3 （0.3%）2 （0.25%）X7 , X7 83 （20%）2 （0.2%）1 （0.05%）3 （0.5%）X8 , X8 93 （20%）3 （0.3%）2 （0.1%）1 （0.1%）X9, X9 u3.根据正交表的培养基配方配制不同 的培养基 u4.正交实验结果测定 u5.发酵结束后，测定每组培养基的平 均产酸量,并填入正交表中，以便分析 使用。 正交试验结果分析:极差法（直观分析法） u（1）计算各因素同一水平之和 u蔗糖因素的三个水平之和分别为A1、A2、 A3 u NH4NO3因素的三个水平之和分别为B1、B2、 B3 u KH2PO4因素的三个水平之和分别为C1、C2、C3 u MgSO4 因素的三个水平之和分别为D1、D2、D3 u（2）计算各因素同一水平的平均值 如： u a1 = A1/3 a2 = A2/3 a3 = A3/3 u 其它因素同样计算 u（3）计算极差R值，决定因素的主次顺序。R值 是各因素同一水平的平均值中最大值减最小值之 极差。如： u A因素 Ra = a中最大a中最小 u B因素 Rb = b中最大b中最小 u C因素 Rc = c中最大c中最小 u D因素 Rd = d中最大d中最小 u比较Ra、Rb、Rc、Rd的大小，确定并排列主 、次要因素。 u为直观起见，用各因素的水平作横坐标，指标的 平均产酸量为纵坐标，画出因素各水平与指标的 关系图。 u平均产酸量(g/100ml) u A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 u（4）选出最优组合： u结合试验正交表中的结果产酸量高者为该次正交 试验的最佳组合，根据上述计算结果可得该次正 交试验的最优组合。 u1.正交试验法的意义。 u2.如何确定试验因素和水平数？ u3.如何利用极差法来分析实验数据？ u4.最优组合与最佳组合为什么有时会 不一致？ 思考题： 实验四 柠檬酸产生 菌的发酵 实验目的 u1.了解机械通风发酵罐的结构及工作原理 ； u2.掌握在通风发酵罐上菌株的发酵实验； u3.熟练费林试剂测糖的操作方法，掌握发 酵曲线的绘制。 u经过菌株的复筛和正交实验得到是最 佳培养基配方，在机械通风发酵罐内 给予微生物较好的生长环境，通过控 制温度、pH值、罐压、通风量、搅拌 转速等因素，使其产生更多的目的产 物。 u在机械通风发酵罐上得到的发酵工艺 更接近工业生产的要求。 实验原理 u1、种子培养基的配制及种子培养 u2、发酵培养基的配制、灭菌、冷却、接种 u根据正交实验得到的最佳配方与最优配方，经过 多次比较后，确定发酵培养基的配方，作为上发 酵罐实验用的发酵培养基。灭菌、冷却、接种。 u3、通风发酵 u发酵过程中通风量的控制： u罐压的控制： u搅拌转速的控制： u在培养过程中如出现剧烈起泡，自动流加植物油 作为消泡剂 。 实验步骤 u4、接种后，分别在不同的时间取样，用 费林试剂法测定残糖，用0.1N氢氧化钠滴 定法测定发酵液中柠檬酸的量，用精密pH 试纸或pH 计测定发酵液的pH 值。 u5、根据发酵时间、糖含量、产酸量、 pH 的数据，绘制出pH值、产酸量、耗糖量变 化曲线与发酵时间的关系图。 u1.实验室如何完成发酵罐的接种操作 ？ u2.工业生产中“压差法”接种的操作过 程 u3.在取样时应如何操作才能保证无菌 ？ u4.如何确定发酵是否结束？ 思考题： 附：还原糖及淀粉含量测 定 实验目的 u1.学习、掌握利用费林试剂测定还 原糖的方法； u2.测定溶液中的还原糖浓度及原料 中淀粉的含量。 u费林甲、乙两液混合后，硫酸铜与NaOH作用生 成Cu(OH)2，Cu(OH) 2又立即与酒石酸钾钠作 用形成可溶性的铜络合物 。 u在碱性溶液中，葡萄糖（还原糖）能很快把这种 络合物中的铜还原成一价铜，生成Cu2O，而黄 血盐存在又可以使Cu2O转变成可溶络盐，不致 沉淀析出 。 u当加入弱于Cu2+的弱氧化剂次甲基蓝作为指示 剂时，在滴定中Cu2+完全还原后，微过量的葡 萄糖也能将次甲基蓝还原，使之蓝色消失，即达 到反应终点 。 实验原理费林法 实验步骤： u（一）还原糖测定实验 u（二）淀粉含量的测定 （一）还原糖测定实验 u1、空白对照的确定： u2、还原糖测定： u3、还原糖浓度计算： u 还原糖含量= C (V0-V)10-3 (g) u式中： V0空白消耗标准葡萄糖液总体 积 (ml) ； V样品消耗标准葡萄糖液总 体积 (ml) ； C标准葡萄糖液浓度 (g/l) u糖浓度 = 含量稀释倍数 / 取样体积 (ml) 10-3 (g/l) u1、淀粉的水解： u2、空白对照的确定： u3、还原糖测定： u4、淀粉含量计算 u原料中淀粉含量 (%)= C（ V0V）5000.9 10 -3 100WVS u = 45 C（ V0V）/ WVS u式中： uC、 V0和V的含意与前述还原糖测定中的计算相同； uW称取原料样品重量 (g)； uVS滴定时吸取样品体积 (ml)； u500样品定容至500ml。 （二）淀粉含量的测定 u（1）费林甲液取样必须准确。 u（2）“4个1”：以4-5秒1滴的速度滴 定 ；滴定在1分钟内完成；滴定消耗 量葡萄糖量控制在1ml以内；每次滴定 误差不超过0.1ml。 u（3）必须在电炉上完成滴定。 注意事项： u1.在还原糖测定实验中，“4个1” 指的是什么？ u2.为什么要预先加入一定量的标准 葡萄糖溶液？ u3.淀粉水解的几种方法。 思考题： 实验五 柠檬酸的提 取 实验目的 u1.了解产物提取的几种方法； u2.学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理； u3.掌握沉淀法提取柠檬酸的方法。 实验原理 u把发酵完成后的发酵液中的目的产物提取 出来，并通过精制成为合格产品，该过程 通常称为后提取。 u后提取是发酵工程不可缺少的部分。 u发酵液过滤（除去菌体） 粗提（根据产物的不同物 理性质或化学性质，使用不 同的方法）精制（脱色， 除去微量杂质，水份，干燥 等）成品。 后提取的流程图： 中和： 2C6 H8 O7H2 O+3CaCO3 Ca3 (C6 H5 O7 )24H2 O+3CO2+H2 O 酸解及H2SO4用量计算： uCa3 (C6 H5 O7 )24H2 O +3H2 SO4 +4H2 O u 2C 6 H8 O7H2O+3CaSO42H2 O u2C6H8 O7H2O 3CaCO3 3H2SO4 u 2210（g） 3100（g） 398（g） u 14（g） 10（g） 9.8（g） u （5.3 ml98% H2 SO4） u本实验采用沉淀法对发酵液中的柠檬酸进 行提取，经过中和、酸解、脱色、过滤、 离子交换、浓缩、结晶和干燥的方法，得 到柠檬酸提取物。 实验说明 u发酵液过滤除去菌体测定含酸量（g/100 ml发酵液）中和（加CaCO3 ）过滤（固液 分离，保留固相）固相加水调浆，加H2SO4酸 解加活性C脱色过滤 离子交换真空浓缩 结晶。 u1、称取CaCO3，加入到70的柠檬酸发酵液 中注意勿使泡沫溢出，至无气泡产生为止， pH6.5。 u2、趁热过滤收集柠檬酸钙沉淀。 u3、滤饼放入烧杯中调成浓浆状 实验步骤 u4、加硫酸酸解，酸解后， pH值为2左右 u5、加入活性碳，保温脱色，并冷却 u6、酸解液真空抽滤，收集滤液 u7、过离子交换树脂 u8、酸解液真空浓缩 u9、常温下结晶。 u10、在 30 35下烘干，称重。 u11、计算提取率 提取率(%)=烘干后的柠檬酸重量 / 发酵 液所含的柠檬酸量 100 u1.在柠檬酸提取实验中，为什么在 酸化时宁可少加一点硫酸？ u2.在柠檬酸提取实验中，影响提取 率的因素有哪几方面？ 思考题： 附：离子交换树脂的使用 、再生及去离子水制备 实验目的 u1.理解交换及再生原理； u2.掌握离子交换树脂的使用； u3.掌握去离子水制备方法。 实验原理（见讲义） 实验步骤 u1.树脂的再生 u（1）装柱：（湿法装柱） u（2）阳离子交换树脂转型（再生 ） u（3）阴离子交换树脂的转型（再 生） u（1）先检验水中Ca2+及SO42-离子 u（2）水先经过阳离子树脂，检验水中Ca2+ 、 SO42- 离子 u（3）用经过阳离子树脂后的水,再经过阴离子树 脂，检验水中Ca2+ 、 SO42- 离子 u（4）若经过阴、阳离子树脂后的水经检验后有 Ca2+ 、 SO42-存在，表明交换树脂已经饱和， 需要进行再生处理。 2.去离子水的制备 实验结果： Ca2+SO42-pH 处 理 前 阴离子树脂处理后 阴阳离子树脂处理后 u1.离子交换树脂使用时，为什么要 湿法装柱？ u2.使用过程中为什么不能让树脂层 断流？ u3.怎样来鉴别阴、阳离子交换树脂 已经“饱和”？ 思考题： 实验六 柠檬酸发酵产 物及提取产品的检测、 鉴定 实验内容 u发酵产物及提取产品的检测、鉴定是微生物发酵 工程中不可缺少的一个部分，它对产物的定性、 定量测定以及产品质量监测、控制有着重要的意 义，是一种必不可少的手段。 u本实验包含有以下三个实验： u附实验一 纸上层析法 u附实验二 薄层色谱法 u附实验三 熔点的测定 附：纸上层析法 实验目的 u1.了解色层分析法的原理； u2.掌握利用纸层析法对发酵液中 的有机酸进行定性分析的方法。 u纸层析是一种微量检定的方法； u固定相的载体是制成特种滤纸的纯纤维素 ； u将待分离物点于滤纸的某一处（起始点） ，根据其在流动相和固定相的分配系数（ 溶解度）不同，从而在展开过程中发现分 离。 u纸上层析系在密闭容器中进行，容器内的 空间必须为所用溶剂体系中的各种组分所 饱和。 实验原理 u展开完成之后，经相应显色后物质斑 点的位置以Rf（比移值）鉴别； uRf值是每个化合物的物征数值，很多 化合物的Rf值已经计算出来，可用于 鉴定。 u1.流动相的制备 u2.点样 u3.展开 u4.显色 u5.观察结果及计算 实验步骤 u1.纸上层析在“点样”时应该注意的 问题？ u2.“显色”时的主要操作要点。 思考题： 附：薄层色谱法 实验目的 u1.学习薄层色谱一般原理； u2.掌握薄层板的制备； u3.利用薄层层析法鉴定产物的操 作方法。 u薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表 示，又称薄层层析，属于固液吸附色谱。 u是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法， 它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。 u一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01g ）的分离； u另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点 成一条线，则可分离多达500mg的样品。因此又可用 来精制样品。 u此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而 不能用气相色谱分析的物质。此外，在进行化学反应时 ，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应 是否完成。 实验原理 u1.薄层板的制备（湿板的制备） u2.薄层板的活化 u3.点样 u4.展开 u5.干燥 u6.显色 u7.观察结果及计算 实验步骤 u1.薄层板的制备应注意哪几点？ u2.点样与展开的要求有哪些？ 思考题： 附：熔点的测定 实验目的 u1.了解熔点测定的意义； u2.掌握熔点测定的操作方法。 u晶体化合物的固液两态在大气压力下成平衡时的 温度称为该化合物的熔点。 u纯粹的固体有机化合物一般都有固定的熔点，即 在一定的压力下，固液两态之间的变化是非常敏 锐的，自初熔至全熔（熔点范围称为熔程），温 度不超过0.51oC。如果该物质含有杂质，则 其熔点往往较纯粹者为低，且熔程较长。故测定 熔点对于鉴定纯粹有机物和定性判断固体化合物 的纯度具有很大的价值。 实验原理 测熔点的方法 u（1）毛细管法测熔点； u（2）熔点测定仪测熔点。 u1.样品的装入 u2.熔点测定 实验步骤 1.样品的装入 u（1）样品粉末要研细 u（2）填装结实，不应留有空 隙 u（3）填装高度23mm，需 反复多次（少量多次） u（4）熔点管外的样品粉末要 擦干净以免污染热浴液体 u用硫酸作加热浴液（加热介质）要特别小心。 u（1）升温：先快后慢（每分钟12oC） u（2）记下初熔温度（晶体开始塌落并有液相产 生时的温度） u（3）记下全熔温度（固体完全消失） u纯化合物的初熔全熔过程一般很短，有时只 能读到一个数 u（4）至少重复两次（用新的熔点管另装样品） 2.熔点测定 u1.测熔点时，若有下列情况将产生什么结果？ u（1）熔点管壁太厚。 u（2）熔点管底部未完全封闭，尚有一针孔。 u（3）熔点管不洁净。 u（4）样品未完全干燥或含有杂质。 u（5）样品研得不细或装得不紧密。 u（6）加热太快。 u2.是否可以使用第一次测过熔点时已经熔化的有 机化合物再作第二次测定呢？为什么？ 思考题： 酒精及酒类方面的综合 实验 （厌氧发酵部分） 厌氧发酵部分 u实验一 糖蜜酒精发酵及提取 u实验二 固定化生长酵母细胞连续生产酒精 u实验三 生料白酒的酿造及蒸馏 u实验四 白酒知识介绍及白酒的品尝 酒精的介绍 u酒精的应用范围越来越广，它是许多化工 产品不可缺少的基本原料，是一种很好的 有机溶剂，也可作为洗涤剂和浸出剂。在 医药上酒精可用于灭菌防腐和药剂的调制 ，高纯度酒精可用来配制各种饮料酒。 u 酒精是一种可以再生的能源，人们已将 酒精与汽油混合，代替部分汽油，缓解目 前燃料油供应越来越紧张的状况。云南省 有80多家甘蔗糖厂，对甘蔗糖蜜的综合利 用具有非常重要的意义。 u自古以来，人们就以酒为饮料，酒具 有一定的营养价值和保健作用，适量 饮酒，对人的身体有较好的保健作用 ；但饮酒过量，特别是经常超量饮酒 ，那就要伤身体了。白酒已是人们的 日常生活中不可缺少的商品，了解一 些酒类生产、酒类品尝和得法的饮酒 习惯方面的知识，是很有必要的；同 时对减少因饮酒不当带来的各种问题 和酒文化知识的普及起到积极的作用 。 实验一 糖蜜酒精发酵 及提取 实验目的 u1.掌握糖蜜的前处理方法； u2.熟悉糖蜜酒精发酵及提取全工艺过 程。 u糖蜜中的物质浓度很大，糖分高，产酸细菌多， 灰分与胶体物质很多，如果不预先进行处理，酵 母是无法进行发酵的。因此必须进行预处理，糖 蜜的处理程序包括稀释、酸化、灭菌、澄清和添 加营养盐等过程。 u酒精发酵作用，是酵母菌把可发酵的糖经过细胞 内酒化酶的作用，生成了酒精和CO2，然后通过 细胞膜将这些产物排出体外，酵母菌就是通过这 种形式进行酒精发酵作用。 实验原理 u1.糖蜜的稀释 u2.糖蜜的酸化 u3.糖蜜的灭菌 u4.糖蜜的澄清 u5.营养盐的添加 实验步骤 u6.酒母培养： u7.发酵培养基的灭菌 u8.接种 u9.厌氧发酵 u10.蒸馏 u11.计算得率。 u1.在糖蜜的处理时，加硫酸酸化的目的？ u2.如何使用酒精计？ u3.糖蜜酒精发酵液中酒精含量的测定方法。 思考题： 实验二 固定化生长酵 母细胞连续生产酒精 实验目的 u1.了解固定化的几种方法； u2.掌握利用包埋固定法对酒精酵 母固定后，酒精发酵的方法。 u目前较合理的固定方法大致有吸附法、共价结合法、交 联法和包埋法四大类。 吸附法 是依据带电的微生物细胞和载体之间的静电 作用，使微生物细胞固定的方法，可分为物理吸附法和 离子吸附法两种。 共价结合法 是细胞或酶表面上功能团(如琉基或羟基 、咪唑基、酚基等)和固相支持物表面的反应基团之间 形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞或酶。 交联固定法 是利用双功能或多功能试剂，直接与细 胞或酶表面的反应基团(如氨基酸、硫基、咪唑基)发生 反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞或酶。 包埋固定法 是将微生物细胞用物理的方法包埋在各 种载体之中。这种方法既操作简单，又不会明显影响生 物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。本实验采 用包埋固定法对酒精酵母进行固定化后，用于发酵。 实验原理 u1.收集培养好的酵母细胞 u2. 无菌水充分混合均匀 u3. 海藻酸钠溶液与酵母液充分混合 u4. 将混有酵母的海藻酸钠溶液滴加到 CaCl2溶液中 实验步骤 u5.在CaCl2溶液中固化 u6. 凝胶珠的培养 u7.用柱式法连续发酵生产酒精 u8.直接取酵母细胞凝胶珠接入倒发酵培养基发酵 u9.蒸馏法测定发酵液中的酒精含量 u10.固定化细胞数量的测定 酵母的固定化和直接发酵产生酒精 酵母的固定化和直接发酵产生酒精 酵母的固定化和直接发酵产生酒精 固定化酵母细胞在柱中发酵情况 附：固定化细胞数量的 测定 凝胶中酵母细胞量测定方法的介绍 u固定化细胞是包埋或吸附于载体之中的细 胞，因此与测定游离细胞的方法有所区别 。 u将介绍测定包埋于凝胶中酵母细胞数的方 法。 1.材料 u（1）待测凝胶珠 u（2）培养基：采用培养酵母的完全培养基 。 u（3）器材：生理盐水、吸管、试管、平皿 、三角瓶、摇瓶机、培养箱。 u（1）将从培养基中取出的二粒凝胶珠溶 解在生理盐水中，形成细胞悬液 u（2）采用稀释法系列稀释分离 u（3）培养 u（4）计数，算出凝胶中的活细胞数。 2.操作步骤 u1.固定化的方法有哪几种？ u2.固定化后的酵母为什么还要再培养？ 思考题： 实验三 生料白酒的酿造及蒸馏 u实验目的 u1.了解生料酒的生产工艺； u2.掌握原料出酒率的计算； u3.了解生料白酒酿造工艺与传统白酒 酿造工艺的不同。 u 在微生物酶及酶制剂的作用下，粮食 作物里所含的淀粉先被糖化，并转化为可 发酵的单糖，再在酒精酵母的作用下转化 为酒精。 u理论上讲：一个淀粉分子可转化为两个酒 精分子和两个CO2分子。 u由于传统的酿酒工艺存在着工艺复杂、难 控制、出酒率低、消耗燃料多等缺点，已 逐步被生料酿酒法所取代。 实验原理 u操作流程： 原料加入生料酒曲、加水拌匀发酵蒸馏酒。 u1.称取大米、酒曲 u2.加水摇匀，培养 u3.保温发酵 u4.蒸馏白酒 u5.原料出酒率计算 以500酒为产品，则500酒的原料出酒率为： 出酒率(%)=W1P/42.43 / W100 式中：W1馏出酒的重量 (g) PP度下的重量百分数 42.43500下的重量百分数 W原料的重量 (g) 实验步骤： u1.生料白酒的酿造过程中实验现象观 察，为什么会出现这样的现象？ u2.生料白酒酿造工艺与传统白酒酿造 工艺的不同点。 u3.原料出酒率的计算方法。 思考题： 附：酿造用水的硬度 测定 实验目的 u1.了解引起水硬度的原因及其危害； u2.掌握水硬度的测定原理及方法。 酿造用水的处理意义 u酿造用水，首先应符合我国生活饮用水的 标准，其中某些项目还应符合酿造用水的 要求，如果某些水中杂质超过上述两要求 ，为了适应工艺需要和提高酿酒质量，应 对酿造用水作适当的改良和处理。 u水的硬度主要由水中钙盐、镁盐等所引起 ，故硬度通常以钙、镁量表示。 uEDTA（乙二胺四乙酸 Ethylenediamine Tetreacetie acid ）其二钠盐与水中钙、镁生 成可溶性无色络合物，指示剂铬黑T与钙、镁形 成酒红色络合物，但EDTA与钙、镁的络合物更 稳定，当在水样中加入蓝色的铬黑T后，生成铬 黑T钙、镁络合物，而使溶液呈红色，再用 EDTA滴定时，生成无色的EDTA钙、镁络合物 ，由于EDTA与钙、镁络合能力较铬黑T强，故 仍能将铬黑 T钙、镁络合物中的钙、镁络合，致 使铬黑T被游离出来，溶液从红色变为蓝色，以 示终点。 实验原理 u1.总硬度的测定 u2.永久硬度的测定 u3.计算公式 实验步骤 1.总硬度的测定 u吸取50毫升水样，置入250毫升