教案-食品掺伪成分的检验.doc

课程名称食品安全授课题目（章节或主题）第十二章 食品中有害成分测定授课教师张怡所属系（部）药学系所属教研室药分教研室职称助教授课时间2013年10月29日 第九周 星期二 第6-7节 第1次课授课时数2学时授课班级 药剂 专业（本科 专科）11级 药剂 班教学课型理论课 实验课 见习课 习题课 讨论课 其它教材名称、作者、出版社及出版时间钟耀广主编、食品安全学第2版，化学工业出版社教学目的要求：掌握食品中内源性毒素、有毒微生物、加工、贮藏过程中产生的有毒、有害物质概念，熟悉、其测定方法。教学重点、难点：掌握食品中内源性毒素、有毒微生物、加工、贮藏过程中产生的有毒、有害物质概念，熟悉、其测定方法。2、重点、难点重点：食品中有毒微生物的测定。难点：加工、贮藏过程中产生的有毒、有害物质的测定。教学方法（请打选择）：讲授法 讨论法 启发式 自学辅导法 练习法(习题或操作) 读书指导法 （以问题为中心的教学法） 其他教学手段（请打选择）：板书 实物 标本 挂图 模型 投影 幻灯 录像 CAI（计算机辅助教学）教学过程设计和教学内容：第十二章 食品中有害成分测定食源性疾病：食物自身有毒或被微生物污染的食品而导致的疾病。食品中的有毒有害物质: 1.食品中内源性有害成分（过敏原、有害糖苷类、凝集素、皂素等）2.食品中外源性有害成分（重金属、农药残留、二噁英、兽药等）3.食物中的真菌毒素第一节 食物中内源性毒素的测定1、自然产生的毒素 贝类毒素及鱼类毒素1） 贝类毒素简介贝类生物体通过食物链，将有毒藻类产生的毒素在体内累积放大，转化为有机毒素，这些毒素统称为贝类毒素( Shellfish Toxins )常见的有毒贝类主要有蛤类、螺类、鲍类。毒素一般积存于贝类的肝脏、消化腺体、中肠腺等内脏器官。2）贝类毒素的类型根据中毒症状，可将有害赤潮藻毒素导致的中毒分为四大类：神经性贝类毒素，麻痹性贝类毒素，腹泻型贝类毒素，健忘型贝类毒素，新型贝类毒素贝毒危害具有突发性和广泛性，且毒性大、反应快、无适宜解毒剂目前我国以麻痹性贝类中毒和腹泻性贝类中毒为常见类型新型贝类毒素：西加鱼毒及近年来在欧洲沿海国家的养殖贝类中发现的一类新贝类毒素。贝毒危害具有突发性和广泛性, 且毒性大、 反应快、 无适宜解毒剂,给防治带来了许多困难,因此开展贝毒研究对确保水产品质量安全具有重要意义。3） 贝类毒素的简介（1）麻痹性贝类毒素 PSP-病原藻：主要来自海洋中的单细胞甲藻，其所产生的毒素为巨蚌毒素石房蛤毒素（STX）新石房蛤毒素（neo-STX）膝沟藻毒素（GTX）病原藻：是目前世界上分布最广，中毒发生率最高的一种贝毒，目前已分离出20 种毒性成份，依基因的相似性分为了3 类：石房蛤毒素（STX），新石房蛤毒素（neo-STX），膝沟藻毒素（GTX）。它们都是以石房蛤毒素（STX）为骨架，由于取代基不同而衍生出多种化合物，其毒性也略有差异-中毒症状：包括唇舌麻木感、皮肤刺痛、晕眩、言语困难、四肢末端灼热感等症状。严重者可能会因呼吸困难、呼吸衰竭而致死。一般而言，如经24小时仍能存活且无并发症者，预后良好。不同的毒性成分其毒害性的强度亦不同，以鼷x鼠腹膜内注射实验，结果显示致死剂量为16 MU / mole到2045 MU/mole，其中MU(mouse unit)为老鼠单位，用来表示巨蚌毒素的毒性强度；1个老鼠单位代表以腹膜内注射方式使一只20克的鼷鼠在15分钟内致死的剂量。Eg：麻痹性贝毒常见于淡菜、蛤蜊、扇贝等双壳贝类。（2）腹泻性贝类毒素 DSP病源藻:为Dinophysis spp.，其所产生的毒素为多元醚化合物：软海绵酸（OA）及其衍生物鳍藻毒素（DTX）13，蛤毒素(PTX)17，虾夷扇贝毒素(YTX)（包括：okadaic acid (OA)、dinophysis toxin (DTX)、pectenotoxin (PTX)及yessotoxin (YTX)）中毒症状：毒之潜伏期与摄取的毒素量有关，一般约为30分钟至23小时内，主要为消化系统不适症状，包括反胃、呕吐、下痢及腹痛，并伴随着畏寒、头痛、发热等症状，症状至多持续23天。一般而言，腹泻性贝类中毒并不会造成死亡，其预后良好且无并发症。例子：腹泻性贝毒素常见于淡菜、牡蛎(oysters)、日月贝(scallops)等贝类。它主要来自于鳍藻属( Di nophysis),它们在世界许多海域都可生长（3）神经性贝类毒素病源藻：Ptychodiscus brevis从短裸甲藻，毒素以脂溶性且耐热的BTX为主BTX主要为持续的刺激神经，导致神经肌肉末稍之抑制。中毒之潜伏期与摄取的毒素量有关，一般约为数min至数hour内。主要为消化系统及神经系统症状，包括下痢、呕吐、腹痛、腹泻、口舌麻木刺痛、肌肉酸痛、晕眩、冷热感异常、运动失调、头痛、倦怠等，症状持续数小时至数天。一般而言，神经性贝类中毒并不会造成死亡，其预后良好，仅少数患者会有副作用。神经性贝类毒素是贝类毒素中唯一的可以通过吸入导致中毒的毒素。神经性贝类毒素的毒理是:与麻痹性毒素相似 ,作用于钠通道 ,引起钠通道维持开放状态 ,从而引起钠离子内流 ,造成神经细胞膜去极化。目前 ,对新鲜的、 冷冻的或罐装制品的牡蛎、 蛤类和贻贝的神经性贝类毒素最大允许限量为 20MU/ 100g （4）健忘性贝类毒素病源藻：为菱形藻科中的拟菱形藻属和菱形藻中硅藻的某些种，毒素以软骨藻酸（DA)为主中毒症状: 恶心、呕吐、腹痛、腹泻等；神经系统症状则约48小时内出现，主要症状为记忆丧失、心律不齐、半身麻痹等；严重者则会产生痉挛及昏迷；老年且出现严重神经症状之患者较易导致死，死亡率约2 %。（5）新型贝类毒素-焦脱镁叶绿酸（Pyropheophorbide，鲍鱼贝毒）焦脱镁叶绿酸a主要存在于鲍鱼体内，这种物质是叶绿素的衍生物，因此可能来自于海藻。这种毒性化合物是有光过敏反应，这种光致敏剂在体内会加速组织胺基酸、色胺基酸和酥胺基酸等产生胺基化合物，并使得器官发炎并产生毒性化学反应。症状通常会在脸部和手部皮肤出现红色的水肿。-氨代螺旋酸贝毒这是近年来在欧洲沿海国家的养殖贝类中发现的一类新贝类毒素 A zaspiracids ( AZA s)。AZAs主要引起人体肠道紊乱，与腹泻性贝毒(DSP)和细菌性肠毒素引起的人体中毒症状极其相似。AZAs毒性比较稳定，常规的烹饪和加工处理无法去除，其毒性远比 OA强，目前还没有找到有效的治疗方法和治疗药物。（6）近年来, 除了上述几种毒素，还不断有新的毒素及其成分被发现，贝类毒素是目前已知的最毒有机化合物, 目前确定有10 余种贝毒其毒素比眼镜蛇毒素高80 倍，检测贝类毒素是水产品检测机构的技术难点和重点。（7）国家质量监督检验检疫总局在 2001 年发布的 GB 18421- 2001海洋生物质量标准,规定：麻痹性贝毒素( PSP) 含量0.8mg/kg。腹泻性贝毒素( DSP) 含量不得超过 80微克 /100 克。4） 贝类毒素的检测方法：生物法：小鼠检测法，细胞检测法，免疫学检测法，化学一起发：生物传感器法，电泳法，色谱法。由于贝类毒素的成分复杂，制约了对它们的深入研究。随着检测方法的不断提高，我们期待有更简便、快速和灵敏的方法进行贝毒检测，保障人类食用贝类的安全（1） 小鼠检测法小鼠生物检验法是将贝类毒素的提取物进行适当的稀释后，对小白鼠进行腹腔注射，并计算平均致死时间。该方法已被列入 AOAC方法，成为国际海产品贸易中贝类麻痹性贝毒的测定方法。小鼠生物检验法是将贝类毒素的提取物进行适当的稀释后 ,对小白鼠进行腹腔注射 ,并计算平均致死时间。根据 Sommer 表,查出相应的 MU (给小白鼠腹腔注射毒素的系列稀释液 ,然后计算每只 20g 小白鼠的剂量作为 1 个死亡时间,以 15min 内杀死 1 只鼠单位 来表示毒性的大小,换算成 MU/ 100g贝肉)。小鼠生物测定法已被 AOAC(美国公职分析家协会)作为国际海产品贸易中贝类麻痹性毒素的测定方法。该方法的缺点：-是由于小鼠的大小以及小鼠个体情况的不同 ,因此造成灵敏度不高 ,偏差较大。-存在实验小鼠用量大以及哺乳动物费用增加的缺陷。-同时操作繁琐 。l 麻痹型贝类毒素检验方法-样品制备：新鲜贝类，贝类罐头，酸保存的贝肉，冷冻贝类，贝肉干制品如： 蛤蜊、牡蛎、贻贝和扇贝类样品，用清水将贝壳外表彻底洗干净，切断闭壳肌，开壳，用清水冲洗内部除掉泥砂和其他外来物。取出贝肉，不要割破肉体。收集200g肉置于10号筛子中沥水5min，拣出碎壳等杂物，将贝肉均质。- 试样保存:均质处理的样品若不能及时检测，可取100g已均质贝肉加入100ml HCl溶液，置于4冷藏保存。尽可能及时检测-测定方法采用鼠单位测定，予以定量。鼠单位测定：对体重为20g的小白鼠腹腔注射1mL贝类提取液后，在15min时杀死小鼠所需的最低毒素量。毒素标准品：saxltoxln，将鼠单位换算成毒素的质量小鼠生物检验法是将贝类毒素的提取物进行适当的稀释后，对小白鼠进行腹腔注射，并计算平均致死时间。根据Sommer表 ,查出相应的MU 毒性的大小换算成 ug/ 100g贝肉l 腹泻性贝类毒素检验方法-样品的制备：生鲜带壳，冷冻带壳，用酸保存的如： 扇贝，贻贝、牡蛎等可以切取中肠腺的去壳贝肉，称量200g贝肉质量后仔细切取全部中肠腺，将中肠腺称重后细切、混合，作为检样。对不便切取中肠腺去贝壳肉样品，可将全部贝肉细切，混合，作为检样。- 避免毒素的危害：应戴手套进行检验操作。移液管等用过的器材及废弃的提取液要在5%次氯酸钠溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解。-测定方法 用丙酮提取贝类中的毒素，再转移至乙醚中，经减压浓缩至干后，用吐温-60生理盐水溶解残留物并注射小白鼠，观察存活情况，计算其毒力。吐温：聚山梨酯由山梨（糖）醇通过三步反应制得。首先，山梨醇脱水形成去水山梨糖；去水山梨糖同脂肪酸如油酸、硬脂酸生成己糖酯；最后在催化剂作用下和环氧乙烷反应生成聚山梨酯。1（2） 细胞检测法细胞检测法是建立在贝类毒素对生物细胞影响的基础上。麻痹性贝类毒素用小鼠的神经细胞瘤检测腹泻性贝类毒素是建立在肝细胞形态变化的基础上许多实验已证明麻痹性贝类毒素的致病机理是通过对细胞钠通道的阻断，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。在AOAC（美国分析化学家协会）的赞助下，进行了用小鼠的验成神经细胞瘤检麻痹性贝类毒素存在的实验。腹泻性贝类毒素的细胞检验法是建立在肝细胞形态的变化基础上的早期用显微镜计数活细胞以检测PSP（麻痹性贝类毒素）的含量，后采用染色法用酶标仪测定，四甲基偶氮唑蓝（MTT）代替结晶紫，效果更好。（3）免疫学检测法免疫学测定方法以抗原-抗体特异性反应为基础，包括凝集反应、沉淀反应、补体反应等。目前已有多种可靠的免疫诊断试剂盒用于分析不同的藻类毒素。特异性含义：1.成对，成组对象相互之间的必然对应选择关系。例如一把钥匙一把锁，钥匙的存在特异的对应锁。例如，酶-底物、抗原-抗体、配基-受体之间的相互辨别和选择性结合反应。画图其原理是将兔子等实验动物暴露在毒素中 ,以功能性抗原刺激兔子产生抗体 ,然后从兔子的血清中提取抗体。抗体可用放射性或荧光物质标记。提取的贝类毒素或匀浆后的贝类组织(如贻贝)暴露于标记物中 ,然后检测抗血清一抗原混合物中放射性或荧光强度以测定样品中的毒素的含量。免疫学方法具有特异性强、 灵敏度高、 方法简便等优点 ,但交叉反应时偏差较大。l 麻痹性贝类毒素ELISA快速检测方法的建立在福建沿海厦门、莆田、宁德三市的零售市场采集织纹螺68份，检测麻痹性贝类毒素。结果应用酶联免疫试剂盒检测麻痹性贝类毒素，全部实验过程在1h之内完成。检测限50gkg，灵敏度25gkg。结论应用酶联免疫技术检测麻痹性贝类毒素简单、快捷，不需要昂贵的设备，对于监控海产食品的麻痹性贝类毒素具有重要的现实意义。（4） 色谱法HPLC法的原理大多是基于离子交换层析分离毒素及后置柱反应器氧化洗脱液产生可检测的稳定衍生物，再进行相关检测。HPLC法是唯一能定性、定量检测出各种毒素组分的技术，HPLC 法发展非常迅速并极有可能代替小鼠检测法成为主要的检测方法。优越性: (1) 灵敏度高 ,专一性强 ,检出限低; (2)在酸性条件下不稳定的基团如氨甲酰基 N 磺基在分析的过程中不会解离; (3)缩短了分析时间 ,通过自动注射技术 ,能处理更多的样品 ,便于进行毒素监控; (4)能提供关于毒素的更多信息 ,能测出每 1 个组分的具体含量及毒性的大小 ,从而有助于比较或了解毒素种类的差异。气相色谱法：软海绵酸，主要应用于 PSP、DSP 和 ASP 的检验上（5）电泳法毛细管电泳法主要用于分离测定PSP毒素中的非衍生毒素，根据各种毒素分子所带电荷量不同将其分离，主要有毛细管电泳 -紫外检测法和毛细管电泳在PSP家族中, 各种毒素分子所带电荷量不同（6）生物传感器法生物传感器是利用生物化学作用产生的高亲和力，将敏感物质的浓度转换为电信号进行检测。大多数用于贝类毒素检测的生物传感器是以免疫学为基础尽管关于生物传感器的研究报道较多，但是目前用于贝类毒素检测的商业化产品并不多见。主要原因：大多数生物传感器只能完成某一特定指标的分析，且不能进行多样品的同时检测，这就使其应用范围受到极大限制；检测的稳定性仍有待进一步验证，生物识别元件的再生及可重复利用问题并未得到根本解决。 针对以上问题，今后的研究趋势大致包括：现场快速筛选检测的功能特点更加突出使用尽可能小型、便携性和自动化的设备，得到高灵敏度的检测结果，且即使是非专业人员也能操作，特别适用于贝毒的快速检测中 目前生物传感器在贝毒检测方面的应用还只是处于实验室阶段，其应用有待进一步发展。2. 贝类的净化排毒及预防贝类一旦染上毒素，其组织将毒素排除需要很长的一段时间，有些贝类甚至需要3年以上的时间才能排除毒素。低温可明显抑制毒素的排除。1）常用的净化方法有温度刺激、盐度胁迫、电击处理、降低pH、氯化处理、臭氧处理、紫外线系统烹饪法：煮、蒸、炸可在短时间内使毒素在高温下因失水而渗出2）麻痹性贝类毒素排除的最好方法是将贝类转移到清洁水体中使其自净eg：Desbins 等的实验表明通过垂直移动水体中的贻贝能达到减轻 PSP 的效果 ,但在毒性水平较高时 ,这种垂直移动的方法受到抑制eg：贝类净化系统：东南亚联盟紫外线系统西班牙含氯消毒剂消毒法法国臭氧法商业罐头工艺流程包括在绝缘套中先充入蒸气预蒸 1520min ,然后将蛤肉分离出 ,去除吸管 ,将剩余蛤肉用温水清洗 ,再压入罐头。预蒸时渗出的肉汤毒素含量一般较高 ,但往往只是其中的一小部分被压入罐头 ,大部分已被去除 ,因此这种加工工艺对降低毒性水平很有效果 ,但其有效性也取决于初始毒素的水平 ,因此使用时应谨慎对待3. 贝类中毒后的处理1）个人预防措施：食用贝类海产前要浸养于清水中一段时间，并定时更换清水，使贝类自行排出体内的毒素 每次进食贝类不要过量，并避免进食其内脏、生殖器及卵子 加工时要彻底烹煮达至沸点，以减低微生物污染所造成的风险 进食贝类后若出现中毒症状，应立即前往邻近医院求医，并将剩余的食物留作调查及化验之用贻贝属是最为常见的容易染毒的贝类 ,比其它双壳贝类(牡蛎、 蛤、 扇贝) 具有中毒早、 毒素吸收率高、 毒素积累水平高且排毒快等特点 ,毒素一般在肝脏中积累较多 ,达到饱和时可占毒素总量的 79 %。扇贝也是一种常见的带毒贝类 ,扇贝组织中毒素主要集中在外套膜和消化腺中 ,而且一年中这些组织一直保持较高的水平。但扇贝的闭壳肌的毒素水平较低 ,低于检测限。此外 ,蛤仔、 仙女蛤、 日本东风螺、 房洲法螺、 鲍鱼、 朝鲜蝾螺、Nept unea arthri t ica 和 N . i nterscul pta(两种香螺)等也常发现毒素2）政府预防措施-建立疫情报告和定期监测制度定期对贝类生长水域采样进行显微镜检查，如发现水中藻类细胞增多，即有中毒的危险，应对该批贝类作毒素含量测定。 -严控被赤潮污染的贝、螺类海产品上市买卖，避免群体性食后中毒-规定市售贝类及加工原料用贝类中毒素限量。-做好卫生宣教，介绍安全食用贝类的方法。3）对病人采取紧急处理-停止食用中毒食品；-对病人采取如催吐、洗胃、清肠等清除毒物的措施；针对不同毒物采用相应的特效或有效解毒剂进行解毒，用输液、利尿、换血、透析等方法，促使体内毒物排泄；采取对症治疗，必要时采取特殊治疗措施；-采取病人标本，以备检验；-及时报告当地食品卫生监督检验所。4. 鱼类毒素的检验分类：主动毒素鱼类：具产毒器官，作为防御和进攻的武器被动毒素鱼类：体内含有毒素，食用后才引起，主要分布在热带海中，不同种类的鱼毒性不同1）河豚毒素(TTX)的检测（1）试样的制备（2）毒性测试 预备实验：分别向2只小白鼠的腹腔内注射原试液各1mL，以s为单位测定致死时间的平均值。 正式实验：分别向两只小白鼠的腹腔内注射稀释后的试液各1mL，测定致死的时间。小白鼠在10min左右死亡时，再加13只小白鼠测定致死时间。同时用1%醋酸溶液1mL注射两只20g左右的小白鼠作阴性对照，并取1只不注射任何液体的正常小白鼠作空白观察。阳性对照即是100%出现该结果的“实验”组，材料是确定的；阴性对照则是肯定不会出现结果的“实验组”，材料也是确定的；之所以加引号，是因为除了实验需要验证的变量，其他条件全部都是一样的，用来排除其他实验情况对结果产生的影响。eg，验证一转基因玉米是否有抗药性，需要选择同种的转基因成功的抗药玉米做阳性对照，无转基因的做阴性对照，从而保证除了该基因其他条件一致；一个成功的实验，通常情况下必须有阳性对照和阴性对照排除其他干扰情况阳性对照是用来检验你的实验操作有没有问题，阴性对照是用来检验你的实验材料有没有问题，（3）毒力计算和表示在该实验取得的35只小白鼠的致死时间也包括生存小白鼠，从短时间开始排列，求中间致死时间，从所得的中间致死时间计算毒量。1MU:1只ICR系体重20g的雄性小白鼠腹腔注射后30min内死亡的毒素剂量原验样1g的毒力：中间致死时间试液的毒力*提取比*稀释倍数ICR(又称swiss Hauschka)来源：为美国豪斯卡(Hauschka)研究所饲养的瑞士种小鼠。后由美国肿瘤研究协会分送各地，取名为ICR。1973年由*国立肿瘤研究所引进我国。毛色：白色。主要特性：繁殖力强。 依一公鼠配母鼠，可以连续同居主要用途：常用于药理毒理研究和生物制品的检定。二、真菌毒素的快速分析方法1. 常见的真菌毒素的种类：镰刀菌， 曲霉真菌，青霉，链格孢属1）黄曲霉毒素（1）种类：4种主要的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，加上代谢物M1可以直接地污染食品和饲料。在所有真菌毒素中，黄曲霉毒素B1的毒性、致癌性、污染频率均居首位。黄曲霉毒素B1是已知各种真菌毒素中最稳定的一种。（2）毒素的分布：黄曲霉毒素常常存在于土壤、动植物、各种坚果特别是花生和核桃中。在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。2）赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）（1）种类：赭曲霉毒素是赭色曲霉属（Ochraceors）和几种青霉属真菌产生的一种毒素，包括A、B、C等7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A毒性最大。赭曲霉毒素A是稳定的无色结晶化合物，溶于极性溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。（2）毒素的分布：赭曲霉毒素A会对多种食用了受其污染饲料的家畜和野生动物的肾脏造成损害。 一般容易感染赭曲霉毒素A的商品包括：大豆、绿豆、绿咖啡豆、酒、啤酒、葡萄汁、调味品、草本植物、猪肾。3）伏马毒素（Fumonisins）（1）种类：伏马菌素是1989年发现的一种新型毒素 白色粉末，易溶于水、甲醇及乙腈-水中。伏马菌素在乙腈-水(1+1)中稳定，在25C下可保存6个月目前至少已鉴定出15种不同的伏马菌素的类似物，但大部分在自然界未被分离到。伏马菌素B1和B2是自然界存在最普遍，且毒性最强（2）分布：伏马菌素大多存在于玉米及玉米制品中，其含量一般超过1mg/kg，研究证实，在大米、面条、调味品、高粱、啤酒中也有较低浓度的伏马菌素存在。4）呕吐毒素 （deoxynivalenol，DON）（1）种类：呕吐毒素(Vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，主要产生菌是禾谷镰刀菌。它可导致动物肠功能紊乱(腹泻，呕吐)，口腔黏膜和真皮损伤，免疫力下降。当呕吐毒素含量超过1 mgkg时，就会引起猪采食量减少，体增重减慢。当饲料中呕吐毒素的浓度达4 mgkg以上时，会导致采食量严重下降、拒食、生产性能降低。（2）分布：呕吐毒素一般在大麦、小麦、玉米、燕麦中含有较高的浓度，在黑麦、高粱、大米中的浓度较低。5）T-2毒素是单端孢霉烯族化合物之一 ，毒性较大单端孢霉烯族化合物是一组镰刀菌的某些菌种产生的生物活性和化学结构相似的有毒代谢产物 它广泛分布于自然界，是常见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素，对人、畜危害较大。烹煮不容易破坏致畸性和致突变性6）展青霉素展青霉素还具有致畸性、致突变性和致癌性。 主要存在于霉烂的苹果和山楂中2.限量要求反刍动物反刍（ch）是指进食经过一段时间以后将在胃中半消化的食物返回嘴里再次咀嚼。反刍动物就是有反刍现象的动物，通常是一些草食动物，因为植物的纤维是比较难消化的。反刍动物采食一般比较匆忙，特别是粗饲料，大部分未经充分咀嚼就吞咽进入瘤胃，经过瘤胃浸泡和软化一段时间后，食物经逆呕重新回到口腔，经过再咀嚼，再次混入唾液并再吞咽进入瘤胃的过程。3.毒素的检测方法取样-磨碎-提取-纯化-分析1） 取样均匀分布（蛋白质），不均匀分布（eg：霉菌）2） 提取提取剂：乙腈-水（jng），是一类含有机基团-CN的有机物）或甲醇-水提取方式：振荡或均质3） 净化（1）液液萃取：是利用化合物在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中的方法。广泛应用于化学、冶金、食品和原子能等工业（2）固相萃取净化：采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程，是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理。方法：使液体样品溶液通过吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。（3）多功能柱净化（4）免疫亲和净化4） 分析定量： 高效液相色谱法 LC-MS/GC-MS半定量 薄层色谱 酶联免疫法4 检测方法用于霉菌毒素官方分析技术：高效液相色谱，薄层色谱，elisa1） 亲和色谱(affinity chromatography，AFC)（1）原理：亲和色谱利用固定相的结合特性实现分离的色谱方法。亲和色谱广泛用于酶、抗体、核酸、激素等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等物质的分离与纯化。特别是对分离含量极少而又不稳定的活性物质最有效，经一步亲和色谱即可纯化几百至几千倍。（2）特点：亲和色谱的优点：选择性高、特异性极强操作条件温和回收率高亲和色谱的局限性：普遍性、通用性不够费用高（3）基本原理：亲和色谱是应用生物高分子物质能与相应专一配基分子可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固地结合于固相载体上制得亲和吸附系统。生物分子上具有特定构象的结构域与配体的相应区域结合，具有高度的特异性和亲和力。（4）亲和层析过程：样品是指：生物高分子物质（核酸，蛋白质，多糖，纤维素等），以蛋白质为例，在用平衡液洗后，我们的目的蛋白就吸附在配体上，其余的杂蛋白随着我们的平衡液被清洗出去，这样我们就留下了我们的目的蛋白，但是为了要收集我们的目的蛋白，我们就用高浓度配体，吧目的蛋白再次的吸附上来，最后收集。（5） 配基的选择根配基应用和性质，可将其分为两类： 特殊配基:有某一抗原的抗体、某一酶的专用抑制剂、某一激素的受体等。 通用配基:可适用于一类物质的分离提纯，如用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基。（6） 亲和色谱操作条件的选择- 吸附条件的选择： 吸附反应条件：最好是自然状态下配体与目的分子之间反应的最佳条件，4下温和条件进行 流速控制：不能太快 吸附时间的控制：延长时间可促进吸附 进样量的大小：减少进样量，可提高吸附效果。（7）样品制备一般地说，杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法以及流动相的离子强度、pH和温度等因素有关。亲和色谱样品预处理的主要程序：颗粒、细胞碎片、膜片段等的去除； 样品的浓缩及除去蛋白酶或抑制剂。（8） 配基与目的物结合条件的选择-配基与目的物的特异性结合需要最适的pH、缓冲液盐浓度和离子强度。-pH不仅能调节配基的电荷基团，也能调节目的物的电荷基团。-中等盐浓度的缓冲液能稳定溶液中蛋白质并防止由于离子交换所引起的非特异性相互作用。（9）流速的控制-提高流速可提高分离速度，但柱效降低。因此，吸附操作要在适当的流动下进行，既-要保证高速度，又要保证高效率。-为了使纯化蛋白能够得到好的洗脱峰、最小的稀释度和最大的回收率，最好使用低流速。最适流速：1.5 Ml/min（10）柱操作柱的大小取决于吸附剂的容量和所需纯化的蛋白质的量。高的容量可以用于粗的短柱大多数情况下，可以采用一次性的塑料小柱和15mL凝胶。（11）亲和色谱操作条件的选择a) 清洗条件的选择：-洗涤缓冲液的强度应介于目的分子吸附条件与目的分子洗脱条件之间如果强度太倾向吸附条件，就很难洗脱下来；如果强度倾向于洗脱条件，就很难吸附。-清洗过度会使目标产物的损失增多，而清洗不充分则使洗脱回收的目标产物纯度降低。-具体操作是样品吸附在上柱之后，必须用几倍体积的起始缓冲液对柱清洗以除去不结合的所有物质。B）洗脱条件的选择-在实际操作过程中，应该在洗脱强度和耐受程度之间做好平衡。耐受程度：不会对我们的目的蛋白等物质造成危害-特异性洗脱:利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液作为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。（针对于我们的目标产物，看我们的洗脱剂和配基谁与我们的目标产物更亲和）-非特异性洗脱:通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是较多采用的洗脱方法。（针对外在的环境，改变外在的环境，进行洗脱）5. 黄曲霉毒素分析1）主要有TLC, ELISA, HPLC等方法。（1）TLC（薄层色谱）法灵敏度和重现性较差；薄层色谱：固液吸附色谱，适用于微量样品的分离，适用于挥发性小或在较高温度易发生变化不能用气象色谱分析的物质。（2）ELISA重现性差，易受样品基质干扰；（3）HPLC法灵敏度和准确度高，重现性好，因此已成为黄曲霉毒素分析的主要手段。（4）以上方法具使用剧毒的黄曲霉毒素作为标定标准物，对检验人员造成一定的伤害。2）（1） 黄曲霉毒素总量和黄曲霉毒素B1的检测免疫亲和柱（IAC）-荧光分光光度计酶联免疫吸附法微柱筛选法（2） 黄曲霉毒素M1的检测免疫亲和柱净化-荧光计快速测定法免疫亲和色谱法-HPLC3）免疫亲和柱（IAC）-荧光分光光度计 （1）黄曲霉毒素总量的检测-特点：以单克隆免疫亲和柱为分离手段克服了使用剧毒的黄曲霉毒素作为标定标准物及毒性的有机试剂分析时间短自动化程度高检测限达1ug/kg,检测范围为1-300ug/kg-原理：免疫亲和柱使用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上，装柱而成。试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇-水提取，过滤稀释后用免疫亲和柱净化，以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来，淋洗液中加溴溶液衍生，再进行检测4）酶联免疫吸附法-黄曲霉素B1的检测（1） Elisa 反应物：酶作用的底物（酶与底物产生颜色反应），酶结合抗体2，血清，抗体1（抗体 抗原的反应）（2）原理：它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。（3）在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（标记物）酶作用的底物（显色剂）（4） 实验方法:1.加样及一定量的抗体，孵育后清洗2.加酶标抗体（二抗）：与一抗结合3.加底物液显色：酶促反应4.终止反应：5.结果判定：OD值（阳性，空白，样品）（5）几种酶标分析仪5）微柱筛选法-用来半定量测定各种食品中的黄曲霉毒素B1，B2，G1及G2的总量-原理：样品提取液中的黄曲霉毒素被微柱管内硅镁型吸附剂吸附后，在波长365nm下显示蓝紫色的荧光环，荧光强度与黄曲霉毒素在一定浓度范围内成正比关系。荧光强度大，黄曲霉毒素含量就高。-灵敏度：5-10ug/ml6）黄曲霉毒素M1的快速检测技术免疫亲和柱净化-荧光计快速测定法免疫亲和色谱法净化-HPLC法 适用范围：测定牛奶，奶粉及低脂牛奶， 脱脂牛奶之中的黄曲霉毒素M1的含量 检测限：奶粉0.08ug/kg 牛奶0.008ug/kg7）赭曲霉毒素A的测定方法直接竞争性酶联免疫吸附测定法间接竞争性酶联免疫吸附测定法8）其他毒素的测定方法-伏马毒素的快速分析技术-呕吐毒素快速分析技术 酶联免疫吸附测定法-T-2毒素的快速分析技术 酶联免疫吸附测定法 免疫亲和柱-荧光分光光度法第二节 食品中有毒微生物的测定看图中的agar，用消过毒的的种菌的棒子占取我们已经前处理的样品，涂在agar上面，根据不同的菌落，我们用的培养基也是不同的，有可能是肝组织，蛋白的等等。画个agar的图样后，培养，培养几天之后，再取一个菌落按比例稀释后用刷子，像男士的刮胡刀涂均匀在agar上，最后数有多少菌群，再乘以他们稀释的浓度倍数。Cfu食品中微生物的数量，在食品卫生学中是作为判定食品微生物污染程度的标志1）旋转平皿计数方法-用液态样品螺旋式并不断稀释地接种到一个旋转的平皿中2） 疏水性栅格滤膜法或等格法-用HGMF过滤样品，然后把疏水性栅格滤膜放置在相应的固体培养基中培养，再观察细菌，酵母菌或霉菌菌落。-用于菌落总数，大肠菌属，粪大肠菌群，大肠埃希菌及霉菌，酵母计数。3） 皿膜系统原理：-在一双层膜系统内还有干燥的营养物质和冷水可溶的胶体物质，以每系统1ml的加样量将样品直接加到基础膜中间，盖上含有凝胶剂和TTC的覆盖膜，培养后细菌在双层膜之间生长即可直接计数。-用于菌落总数，大肠菌群，大肠埃希菌，霉菌，酵母和金黄色葡萄球菌计数4）酶底物计数-用于大肠菌群和大肠埃希菌计数-原理：大肠菌群特有的-D-半乳糖苷酶系统能分解吡喃半乳糖为某中间产物，该物经氧化生成水不溶性蓝色二聚物。-大肠埃希菌特有-葡萄糖苷酶能分解4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸为葡萄糖苷和甲基伞形酮，在366nm下产生荧光5） 直接外荧光滤过技术-用一特殊膜滤过样品，经吖啶橙染色后，用紫外光显微观察-活细胞呈橙色荧光，死细胞呈绿色荧光6）“即用胶”系统 据培养基不同分别用于菌落总数，大肠菌数，大肠埃希菌计数和霉菌，酵母菌计数，以及弯曲杆菌的计数。7）用于估计微生物数量的新方法阻抗法：用电阻抗作为媒介，以监测微生物代谢活性为基础的一种快速检测方法Bactometer: 周围液体的电导改变，电导改变时为DT,可指示微生物阈值Malthus:大分子分解成带电荷的小分子，电导度产生改变的时间与初始菌数的反比关系ATP生物发光技术（BL）：所有的生物都含有ATP，当荧光酶系统与ATP接触时就会发光8）微生物的检测沙门菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌李斯特菌第三节 食品加工，贮藏过程中产生的有毒有害物质的检测1. N-亚硝基化合物的检测1）热能分析仪 能检测出烟草和烟气中所有的13种（含烟草特有的）亚硝胺：NDMA、NMEA、NDEA、NPYR、NDPA、NPIP、NBPA、NDBA、NDELA、NNN、NAT、NAB和NNK。高选择性,高灵敏度的特点结合GC（气相色谱）适用于亚硝胺的定量分析。基本过程：用GC对含有亚硝胺的混合物进行分离在热解室中特异性催化裂解产生NO基团过滤除去杂质热分析仪仅能检测NO基团。GC工作过程：仅仅挥发性样品能被分析。确定样品中的成分，成分的纯度，浓度。2. 苯并a芘的检测1）荧光分光光度法-样品经有机溶剂（皂化）提取-经液液萃取或色谱柱净化-在乙酰化滤纸上分离苯并a芘-UV下呈蓝紫色荧光斑点-将分离后的苯并a芘的滤纸部分剪下-溶剂浸出-荧光分光光度计检测荧光强度苯并芘存在于煤焦油中，而煤焦油可见于汽车废气（尤其是柴油引擎）、烟草与木材燃烧产生的烟，以及炭烤食物中，食物加工例如烧烤、烟熏肉类或鱼类的含量亦较高。“。苯并芘为一种突变原和致癌物质，从18世纪以来，便发现与许多癌症有关。其在体内的代谢物二羟环氧苯并芘，是产生致癌性的物质。3. 杂环胺的检测 固相萃取-HPLC法4. 油脂氧化及加热产物1）酸价的测定-水解程度 中和1g油脂所含游离脂肪酸过量时所需KOH的质量 原理：油脂中的游离脂肪酸与KOH发生中和反应，以KOH消耗的量计算 计算:酸价=V*c*56.11/m2） 检测方法滴定法（国标法）试纸法比色法色谱法近红外光谱法电位滴定法3） 酸价影响因素酸价是脂肪中游离脂肪酸含量的标志，脂肪在长期保藏过程中，由于微生物、酶和热的作用发生缓慢水解，产生游离脂肪酸。而脂肪的质量与其中游离脂肪酸的含量有关。一般常用酸价作为衡量标准之一。在脂肪生产的条件下，酸价可作为水解程度的指标，在其保藏的条件下，则可作为酸败的指标。酸价越小，说明油脂质量越好，新鲜度和精炼程度越好。油脂酸价的大小与制取油脂的原料、油脂制取与加工的工艺、油脂的贮运方法与贮运条件等有关。例如：成熟油料种子较不成熟或正发芽生霉的种子制取油脂的酸价要小。甘油三酸酯在制油过程受热或解脂酶的作用而分解产生游离脂肪酸，从而使油中酸价增加。油脂在贮藏期间，由于水分、温度、光线、脂肪酶等因素的作用，被分解为游离脂肪酸。于油中而使酸价增大，贮藏稳定性降低。4）我国食用油分级管理的酸价卫生标准品 名酸价（mg KOH/g）菜子原油、大豆原油、花生原油、葵花籽原油、棉籽原油、米糠原油、油茶籽原油、玉米原油4.0成品菜子油、成品大豆油、成品玉米油和浸出成品油茶籽油一级0.2二级0.3三级1.0四级3.0成品葵花籽油、成品米糠油和浸出成品花生油一级0.2二级0.3三级1.0四级3.05）过氧化值的测定-氧化程度原理：油脂氧化过程产生过氧化物，当与碘化氢反应时析出碘，用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算过氧化值。计算：过氧化值%=C*(V1-V2)*0.1269/m*100%6)健康油脂氧化酸败产生的一些小分子物质在体内对人体产生不良的影响，如产生自由基，所以过氧化值太高的油对身体不好 。7) 皂化值的测定-油脂