课件：胃癌化疗多药耐药研究进展.ppt

胃癌化疗多药耐药研究进展,上海交通大学附属第六人民医院消化科 陈金联,胃癌是我国常见的恶性肿瘤，且中晚期癌(进展期癌)占很大的比例。化疗是其治疗的重要手段之一。由于肿瘤细胞的耐药性，化疗疗效常欠理想。 20世纪60年代末，Biedler和Riehm在中国仓鼠肺细胞上成功地筛选出对放线菌素D耐药的细胞株，这种细胞株对结构与作用机制不同的多种药物，如长春新碱、柔红霉素和丝裂霉素等产生耐药性，此种现象称多药耐药性(multidrug resistance, MDR)。,MDR包括原发性或继发性耐药。原发性耐药指化疗开始时已经存在，继发性耐药指在化疗过程中产生的耐药性。MDR是导致肿瘤化疗失败的原因之一，目前较为明确的机制包括：多药耐药基因mdr1及其编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)过度表达；多药耐药相关蛋白（MDR-related protein, MRP）基因及其家族MRP26的过度表达；肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein, LRP)的过度表达；谷胱甘肽S转移酶(GST)的活性增加，DNA拓扑异构酶(topoisomerase, ToPo)量和质的改变 。,Pgp、MRP和LRP同属细胞膜ATP结合蛋白大家族(ATP-binding cassette superfamily)的成员，是导致肿瘤细胞多药耐药的重要原因。目前已发现该基因家族有五十多个成员。,一、胃癌的化疗,(一)胃癌化疗药物,常用药物有5-氟尿嘧啶（5-FU）、丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、顺铂（Cisplatin, CDDP）和卡铂等，其化疗疗效约20%。Paclitaxel（taxol）是从太平洋红豆杉树皮分离出来，阻碍形成微小管的主要蛋白质tubulin而发挥抗癌作用；taxotere系从欧洲红杉叶来源的半合成taxol 类似物，已用于胃癌联合化疗中。喜树碱（camptothein,CPT）为中国喜树碱提出的植物生物碱，系拓扑异构酶(topoisomerase)型阻断剂。其衍生物CPT-11 在临床期试验中，对进展期胃癌有效率约20%。,(二)联合化疗,胃癌化疗常用的是5-FU、FT-207、UFT、氟铁龙（furtulon, 5DFUR）等氟尿嘧啶类与丝裂霉素、顺铂、卡铂、阿霉素和表阿霉素（epirubicin,THP）等12种药物联合应用。 CPT-11与CDDP有协同作用，临床二期试验中，疗程的第1天用CDDP 80mg/m2, 第1天和第15天用CPT-11 70mg/m2,每4周重复，50%存活期为10个月。EAP（Etoposide+Adriamycin+CDDP）是强力化疗，主要适用于身体状况及一般情况较好的病人，因其副作用较大。,(三)新辅助化疗,胃癌确诊时多数已属晚期，单纯根治术5年生存率仅为40%左右，即使采用扩大根治术亦未能显著提高术后生存率。因为肿瘤存在亚临床转移，即使肿瘤在早期阶段亦可出现亚临床转移，单纯手术切除难以清除微小亚临床转移灶，因而导致术后转移、复发，近年对胃癌患者应用围手术期辅助化疗，包括术前辅助化疗，又称新辅助化疗。,胃癌术前辅助化疗，对于不能手术的胃癌有效，而且对手术后有肝转移和淋巴结转移者有作用。它能延长患者的生存期。此外，胃癌术前化疗可使胃癌TNM分期减低的作用，如原有肝转移的第期不能手术的胃癌患者，术前化疗后可能使手术成为可能。 常用的药物为5-FU、CDDP、阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素、拓扑异物酶抑制剂，CPT-11及VP-16、MTX、Taxol、Taxotere等。一般主张联合应用化疗药物。,二、胃癌多药耐药机制,(一)ATP结合蛋白与胃癌耐药,（1） Pgp、MRP和LRP的基因定位及其蛋白结构 Juliano 和Ling 首先观察到具有MDR表型的中国仓鼠细胞株的细胞膜上，相对分子质量为170KD的糖蛋白过度表达，此糖蛋白能调节细胞渗透性，取名为P-糖蛋白（Pgp）。人 Pgp家族由mdr 基因家族编码，又分为Pgp(Pgp)与Pgp，分别由mdr1和mdr3基因编码。一般Pgp过度表达与MDR有关。人类mdr1基因由4 500个碱基对组成，位于7号染色体q21上，其mRNA为4.1kb。,Pgp是由1280个氨基酸构成，并组成2个同源部分，每一部分包含6个跨膜功能区和1个ATP结合点。跨膜功能区具有疏水性，ATP结合点则为药物的泵出提供能量。如果2个ATP结合点的任何一个失活，则导致细胞的MDR功能丧失。Pgp和己知的许多转运蛋白，如溶血素B、白细胞毒素等的结构和功能相似。抗癌药物通过被动扩散到细胞内，然后与细胞膜糖白结合依靠ATP水解供能而主动泵出细胞外，从而导致肿瘤细胞多种耐药性。,1992年，Cole等在两种非Pgp MDR细胞株上首先发现一种膜转运蛋白基因过度表达并命名为mrp，其编码蛋白质为MRP，基因定位于16p13.1。mrp与mdr1基因有14%的同源序列。mrp mRNA全长6.5kb，编码1531个氨基酸组成的分子量为190KD的蛋白质。MRP结构与Pgp相似。 MRP和Pgp有19%同源性。MRP碳末端核酸结合位点上末位12个氨基酸为特征性标志，MRP和Pgp在第5、8两个氨甚酸位点上不一致。,MRP家族其他5个成员，分别命名为MRP2、MRP3、MRP4、MRP5和MRP6。MRP6与MRP基因均定位于染色体16P13, 外显子均为31个。编码MRP 35的基因与MRP基因不在同一染色体上。MRP基因家族分为两组，一组包括MRP1、MRP2、MRP3和MRP6，氨基酸序列同源性45%48%，特征为氮末端延伸200个氨基酸与5个胯膜片段结合；另一组包括MRP4和MRP5，与MRP1同源性34%39%，与Pgp相似，氮来源无上述延伸结构。,1993年Scheper等在肺癌细胞株上发现相对分子质量为110 000的蛋白(LRP)过度表达，并认为是导致该细胞MDR的主要原因。通过荧光原位杂交技术发现LRP基因定位于16号染色体短臂16p13.116 p 11.2，与MRP的基因位置相近。LRP基因长2.8kb。LRP基因测序表明，氨基酸序列有87.7%与褐鼠的穹窿体主蛋白(major vault protein，MVP)具有同源性，因此LRP可能是人的MVP。,（2） Pgp、MRP及LRP的组织分布与生理功能,Pgp在大多数正常组织中含量较少，但在肾上腺、胰腺、肝、肾、空肠和结肠中有较高水平的表达。Pgp在肝和胰腺主要分布于小胆管、小胰管腔面，肾脏为近曲小管腔面，空肠和结肠为黏膜上皮的肠腔面。Pgp在上述组织中的这种极性分布可能与胰液分泌以及体内毒物从尿液、胆汁和肠腔中排出。此外，大脑和睾丸血管内皮亦高度表达Pgp，而在其他血管中末见Pgp表达。,MRP主要分布在肺、肌肉组织、睾丸和外周血单个核细胞内，而在肝脏、大肠、十二指肠、肾脏、卵巢、胎盘和脑组织等表达较低。MRP主要定位于细胞膜上，内质网、高尔基复合体亦有少量分布。MRP的底物是与谷胱甘肽的亲脂性复合物以及阴离子残基，包括白细胞三烯C4、D4、E4，以及S-（2，4-二硝基苯酚)谷胱甘肽。此外，某些两性阴离子化合物，尤其是谷胱甘肽、葡萄糖酸酯及硫酸盐等的偶合物是MRP的底物。,在剔除MRP基因(Knock-out)模型研究中发现，MRP对于谷胱甘肽结合物的转运具有重要作用。MRP2主要表达在肝细胞的毛细胆管膜上，正常肾脏小管细胞的管腔膜以及空肠、十二指肠上亦存在。突变小鼠(TR-/GY或EHBR)肝细胞小管膜上缺乏MRP2蛋白表达，则表现为Dubin-Johnson综合征。MRP3主要分布在肝、结肠、小肠和肾上腺，而胰腺、肾脏和前列腺中有少量分布。MRP3在肝脏中定位于肝内胆管上皮细胞膜以及门脉周围的肝细胞膜。MRP6主要分布在肝和肾脏。目前有关MRP25的生理功能仍不甚清楚。,LRP在人体多种组织中表达，如肾上腺皮质、支气管内皮细胞、肠黏膜细胞、近曲小管、复层上皮等组织，肝胆小管末见LRP。LRP在上述组织的分泌或排泄功能中可能具有重要作用。,（3）Pgp、MRP和LRP与MDR机制,Pgp是能量依赖的外排泵，能将细胞多种亲脂性药物(如长春新碱、柔红霉素、多柔比星、丝裂霉素、VP-16等)从肿瘤细胞内泵出细胞外，从而导致肿瘤细胞多种耐药性。Pgp作用的底物为非结合形式的药物。 Cole报道，MRP亦是能量依赖的外排泵。MRP主要转运以谷胱甘肽、葡萄糖酸酯或硫酸酯的结合物形成的抗癌药物，亦可以药物原型形式转运。,Kool等在胃癌细胞株上发现MRP2 mRNA水平增高。MRP2可致肿瘤细胞对某些化疗药物(如顺铂、长春新碱)产生耐药性。Kool发现MRP3可引起转染细胞对甲氨蝶呤、依托泊苷的耐药性。由于MRP3对GSH的亲和力小于MRP1和MRP2，所以MRP3转运某些有机分子的能力相对低，致MRP3的耐药谱比MRP1和MRP2窄。MRP4、MRP5和MRP6与MDR无关。,LRP与MDR：使那些以细胞核为靶点的药物不能通过核孔进入细胞核，有些药物即使进入了核内亦被转运到胞质中；使细胞质中的药物进入运输囊泡，并通过胞吐机制排出细胞外。LRP介导以DNA为靶点的抗癌药物耐受，如顺铂、卡铂和烷化剂等，这些药物耐受性不能由Pgp和MRP介导。应用逆转录PCR和双酶标免疫组化技术发现，在MDR同一细胞株上同时存在mdr1、mrp基因及Pgp和MRP表达，说明多药耐药机制的复杂性和多样性。,（4） Pgp、MRP和LRP的临床意义,Pgp、MRP和LRP蛋白及其基因表达水平与人类肿瘤原发性和获得性耐药有关。Yeh研究了Pgp在胃癌中表达与化疗疗效（含柔红霉素或依托泊苷的方案）之间的关系，发现30例患者中3例Pgp阳性，其中无一例化疗有效，但27例阴性中19例化疗有效(P=0.041)，说明Pgp与胃癌化疗反应相关。Ichiyshi 等研究发现胃癌中MRP表达者则对阿霉素和Etoposide等耐药。,Endo 在4种胃癌细胞株、43例胃癌组织及17例癌旁正常组织中,RT-PCR、Southern杂交及免疫组化结果表明，MRP在胃癌组织中阳性表达为53.5%，在正常胃组织中为88%，在胃癌细胞株中为75%（3/4株）。MTT法测定了标本对顺铂、柔红霉素和VP-16的敏感性。结果表明，不表达MRP的对柔红霉素、顺铂和VP-16较敏感。4种胃癌细胞株中MRP表达阴性者对顺铂、柔红霉素和VP-16较敏感。 最近的研究发现MRP2、MRP3与柔红霉素、顺铂、长春新碱等耐药性有关。,(二)p53与胃癌耐药,P53是目前与化疗敏感关联较高的基因，不仅与凋亡和DNA修复有关，而且在恶性肿瘤中突变率最高。,（1）p53与细胞周期阻滞,p53可引起G0/G1期和G2/M期阻滞：（1）由野生型p53激活片段（WAF1）基因产物p21介导G0/G1期阻滞。p21为周期素依赖性蛋白激酶抑制剂，p21水平增高，导致Rb蛋白磷酸化不足，阻止转录因子E2F活性，因此细胞周期阻滞于S期前。（2）调节增殖细胞核抗原（PCNA）。p21作用于DNA聚合酶和的辅助因子PCNA，使PCNA受抑，G1和G2期阻滞。另一受p53调控并影响细胞周期动力学的基因是GADD45（growth arrest DNA damage），其通过结合PCNA抑制DNA合成，并有DNA修复的作用。近期还发现p53还有p21非依赖性G0/G1期阻滞，涉及一个“Siab”的蛋白家族。（3）p53及其效应因子p21尚参与细胞周期第二检测点G2/M过度期协调，主要发生于pRb阴性细胞，否则，p21仍以介导G1期阻滞为主。（4）p53调控的14-3-3蛋白是DNA损伤制剂诱导的强表达蛋白，其功能是导致G2期阻滞。G2/M阻滞的细胞更易导致凋亡。在正常细胞和肿瘤细胞都存在药物诱导p53表达所致细胞周期阻止现象。,（2）p53对细胞凋亡的调控,p53激活凋亡途径,一是p53依赖的序列特异性反式激活（SST）途径，诱导表达p53下游的凋亡相关基因，p53诱导凋亡的主要途径；另一途径是非SST性凋亡，p53与涉及DNA合成、修复及凋亡的蛋白结合成蛋白复合体调节凋亡的发生。正常情况下bax、bcl-2构成异二聚体维持细胞稳定，当p53接受刺激信号后可诱生bax使bax、bcl-2失去平衡，触发凋亡途径。p53还通过bcl-2基因p53依赖性负应答抑制bcl-2表达，bcl-2可在细胞周期的多环节上防止p53诱导的凋亡和细胞周期阻滞；p53能诱导肿瘤细胞表面的CD95表达，p53的激活还促使胞浆内的死亡受体重新分布至胞膜。 p53的促凋亡作用使得肿瘤细胞可能对抗癌剂更敏感；而其细胞周期阻滞作用又有益于DNA的修复，增加对DNA损伤化疗制剂的抗性，显示出p53对化疗敏感性调节的两面性。,（3）p53对化疗药物敏感性的影响,Cascinu 等对局部进展期不能被切除的30例胃癌进行化疗，化疗方案为每周顺铂40mg/m2，表阿霉素35 mg/m2，5-FU 500 mg/m2,6S-Leucovorin 250 mg/m2, 及谷胱甘肽1500 mg/m2共8次。以CT和内镜评价治疗效果，作者发现P53阴性者化疗的反应率显著高于P53阳性者（71%与12%，P= 0.004）。作者认为术前P53状态与胃癌病人化疗反应有关。P53可结合DNA断端，进行错配修复；可结合DNA的特定序列，阻止DNA复制；激活抗增殖基因的表达，使细胞停止于G1期，限制细胞的分裂。P53基因发生突变，则肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性差。,（4）p53调控肿瘤细胞药物敏感性分子机制,MDR1基因 组织蛋白酶D（CD） 在卵巢癌、肺癌和白血病等肿瘤细胞系发现暴露于阿霉素后，CD mRNA水平改变与p53状态有关，普遍存在野生型p53肿瘤CD mRNA表达水平增高，而在突变p53表达水平降低，并且在CD启动子区域发现2个与p53蛋白特异性结合的DNA位点，用组织蛋白酶抑制剂抑胃酶肽A1可抑制p53依赖性凋亡。,（4）p53调控肿瘤细胞药物敏感性分子机制,微管相关蛋白4（MAP4） PAG608（p53激活基因608） GML基因 糖基磷脂酰肌醇锚定分子样蛋白基因，该基因启动子区域内含子包括p53结合位点，介导p53的细胞生长抑制作用，在体外参与p53诱导的细胞周期控制和DNA损伤制剂引起的凋亡发生。在NSCLC病人GML基因表达率为30%，普遍表达于免疫组化染色p53阳性患者，并与CDDP敏感性密切相关。,（三）谷胱甘肽S转移酶,谷胱甘肽S转移酶（GST）是一组具有解毒和结合蛋白功能的同工酶。根据其结构、生化和免疫学的特点不同，GST分为碱性（类）、中性（类）和酸性（类，大鼠为P）三大类，均为二聚体，三类之间无交叉免疫作用。前两类在人体主要分布于肝脏，后一类分布于胎盘中，亦称GST-，为胎盘型 GST。GST-与消化系肿瘤的癌变及抗癌药的耐受相关。GST-是首先从胎盘中分离纯化，肺、红细胞、胆管及胆囊上皮均含有大量的GST-。GST- 活性部位具有一个 GSH的结合位点和一个亲电子物质的结合位点。GST-通过酶促和非酶促反应，保护细胞免受促癌剂、脂质和DNA氢过氧化物的毒性。已发现GST-P与胃癌等肿瘤MDR相关。,（四）DNA拓朴异构酶,DNA拓朴异构酶（ToPo）定位于细胞核，它的含量和活性的改变与某些肿瘤的耐药性有关。以ToPo为靶点的药物，通过冻结DNA裂开酶复合物产生DNA断裂，最终导致细胞死亡。这些药物包括依托泊苷、替尼泊苷和多柔比星等。,Son等用多柔比星浓度逐步递增法筛选人胃癌细胞株（MKN45），结果耐药细胞株（MKN/ADR）对以ToPo为靶点的药物（如依托泊苷、米托蒽醌）产生交叉耐药性，但对顺铂、卡铂、氟尿嘧啶或丝裂霉素无交叉耐药性。经测定，MKN/ADR细胞株中无Pgp表达，但ToPo酶活性较MKN45中低3倍，ToPo在MKN/ADR耐药细胞中含量较MKN45中低20倍，而ToPo无变化，表明ToPo在多柔比星、依托泊苷等抗癌药物耐药中起重要作用。,（五）细胞凋亡与胃癌耐药,Bcl-2为抗凋亡基因，在肿瘤细胞中Bcl-2过度表达可降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。在淋巴瘤、小细胞肺癌中，Bcl-2的高表达与化疗耐药有关，以反义Bcl-2寡核昔酸转染细胞以封闭Bcl-2的蛋白质表达后，转染细胞对化疗药物诱导的凋亡的敏感性大大增加。Bax有促凋亡作用，在耐药的白血病细胞和卵巢癌细胞中Bax的表达明显减少，慢性淋巴细胞白血病病人其Bcl -2/Bax的比值与化疗敏感性成反比。Bax 低表达的乳腺癌细胞MCF-7转入Bax基因后，显著地增加了肿瘤细胞对表阿霉素诱导的凋亡的敏感性。,Ikeguchi等研究发现顺铂可诱导胃癌细胞凋亡，经顺铂处理后，野生型P53（+）、bcl-2(-)的胃癌细胞株MKN-45和MKN-74细胞凋亡指数显著高于突变型P53（+）或P53（-）、bcl-2（+）的胃癌细胞株HSC-39、MKN-28和KATO-胃癌细胞凋亡指数。结果表明，P53、bcl-2表达状态可作为胃癌病人化疗敏感性的预测指标。Takahashi等研究发现，低浓度顺铂（CDDP）不仅可以抑制胃癌细胞株STKM-1胃癌细胞增殖，而且可以诱导其凋亡，咖啡因与CDDP联合应用组胃癌细胞凋亡指数显著高于CDDP组。Inda等研究发现，术前注射5-FU可显著增加胃癌细胞凋亡指数（ 10.46%与6.56%），而bcl-2表达可以抑制5-FU诱导的细胞凋亡。,Fas为跨膜糖蛋白受体，与肿瘤坏死因子受体（TNFR）属同一超家族。Fas抗原表达阳性的卵巢癌细胞，体外培养获得耐药性后，则Fas抗原表达下降。Hayashi等研究发现，Fas抗原在6株胃癌细胞株MKN-45、MKN-1、MKN-7、KATO-、MKN-28、MKN-74胃癌细胞中均有不同程度的表达，抗Fas单克隆抗体可诱导胃癌细胞凋亡，其诱导凋亡的敏感性与Fas抗原表达水平呈正相关。Yamamoto等发现，TGF-1诱导胃癌细胞凋亡，通过非P53途径。Yanagihara等研究发现，经射线照射后，胃癌细胞凋亡指数明显增加。Hibasami等发现绿茶素（green tea catechins）可诱导胃癌细胞株KATO-胃癌细胞凋亡。,（六）TS、TP与胃癌耐药,胸苷酸合成酶(TS)表达增强的细胞对5-FU具有耐药性。而胸苷磷酸化酶(TP)表达增强的细胞对5DFUR表现出敏感性。对胃癌化疗前的组织标本研究表明，TS mRNA或者TS蛋白的表达与5-FU化疗的敏感性有关。活检标本定量RT-PCR表明，TA/-actin 之比可以作为评价5-FU化疗敏感性的指标，TS过量表达的病例对化疗几乎无效。CPT-11对TS过量表达的病例有效，可望成为二线化疗药物。,（七）线粒体基因组与肿瘤耐药,(1) 线粒体基因组(mtDNA)的结构 人mtDNA是一个环状16569碱基的分子，编码氧化磷酸化所必需的成分，还包括线粒体蛋白合成所需的12S、16SrRNA基因及22tRNA基因。MtDNA的密码子不同于nDNA，线粒体特异性核糖体、tRNA及其它成分参与线粒体转录。mtDNA编码的13种肽对呼吸链上4种复合物是特异性的，7种是NADH脱氢酶成分（ND1-ND6），1种参与构成CoQ-细胞色素C还原酶即细胞色素B，还有3种是细胞色素C氧化酶、亚单位成分，剩余2种构成ATP合成酶（FoF1、F1是ATP合成酶的催化蛋白，Fo是ATP合成酶离子诱导部分）。mtDNA转录的一条mDNA, 链上同时含有13种肽和tRNA和mRNA并可同时翻译，因此它们的表达不需其它特异性因子协调。线粒体基因编码的蛋白均参与线粒体的氧化过程。,(2)mtDNA与肿瘤耐药,MtDNA缺失可增加细胞对顺铂的敏感性，这种作用可经转化正常血小板线粒体逆转，但bax、bcl-2、多药耐药基因（MDR）及多药耐药性相关蛋白（MRP）的mRNA表达无改变。 mtDNA与耐药和P-gp基因表达有关。,三、胃癌多药耐药性逆转,Pgp或MRP相关MDR的药物逆转剂,目前已应用于临床作MDR逆转治疗的药物主要包括钙通道阻滞剂和环孢素及类似物PSC833等。 Litchman等用PSC833联合化疗治疗难治性和复发性白血病，总有效率为44%，其中完全缓解率为32%，部分缓解率为11%。,钙拮抗剂异搏定、环孢菌素A、利血平、奎尼丁以及蒽环类等对实体瘤的效果不理想，而且毒性大，限制了其临床应用。槲皮素（quercetin）及其衍生物是植物界分布最广的黄酮类化合物，近期研究发现槲皮素是强有力的MDR逆转剂，并且由于它是天然黄酮类物质，广泛存在于水果、蔬菜及多种中草药中，毒副作用低，在肿瘤的化学治疗中具有十分良好的应用前景。槲皮素可抑制其MDR1基因的转录活性，减少P-gp的表达。槲皮素可逆转MRP介导的MDR。,四、多药耐药基因的检测,(一)多药耐药基因的检测,体外MDR株有耐药基因扩增，但人体内肿瘤耐药细胸内常无耐药基因扩增，因此临床标本一般不检测基因扩增。检测基因扩增的方法有聚合酶链反应(PCR)和Southern blot分子杂交技术。,(二)多药耐药基因mRNA表达程度检测,mRNA检测方法有Northern blot、RNA酶保护法、mRNA原位杂交及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等，其中以mRNA原位杂交及RT-PCR法常用，因其可分析少量活检