课件：江南大学糖代谢与控制副本.ppt

第四章 糖代谢与控制 生命科学学院 胡庆森,3.1 糖代谢与调节 3.2 微生物发酵法生产D-核糖 3.3 微生物发酵法生产柠檬酸,糖代谢的途径,糖代谢的主要途径有：,1.糖的酵解途径EMP途径,2.TCA循环,3.HMP途径（磷酸戊糖途径）,4.ED与PK 途径（不作为重点，自学）,4.1 糖代谢与调节,2019,糖酵解(glycolysis)一词来自希腊语 (glykys meaning “sweet,” and lysis, meaning “splitting”)，该途径的全过程已于1940年完全弄清楚。 糖酵解途径是葡萄糖经1,6-2磷酸果糖降解为丙酮酸的过程，又称为EMP途径(Embden-Meyerhof Pathway）或HDP途径（双磷酸己糖途径）。 从葡萄糖开始降解到生成为丙酮酸，包括10个独立但连续的反应。,4.1.1 糖酵解(glycolysis)途径的特点及调节机制,2019,+,丙酮酸,裂解,脱氢,异构,产能,脱水,异构,2019,糖原（或淀粉）,1-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖,6-磷酸果糖,1，6-二磷酸果糖,3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮,21，3-二磷酸甘油酸,23-磷酸甘油酸,22-磷酸甘油酸,2磷酸烯醇丙酮酸,2丙酮酸,耗能阶段,产能阶段,葡萄糖,EMP途径,+2ATP,+2ATP,-1ATP,-1ATP,无氧条件下即可反应,2019,产能步骤：,3-磷酸甘油醛脱氢酶,磷酸甘油酸激酶,2019,糖原（或淀粉）,1-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖,6-磷酸果糖,1，6-二磷酸果糖,3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮,21，3-二磷酸甘油酸,23-磷酸甘油酸,22-磷酸甘油酸,2磷酸烯醇丙酮酸,2丙酮酸,葡萄糖,+2ATP,+2ATP,-1ATP,-1ATP,2019,EMP途径总的反应式如下所示。 C6H12O6+2ADP+2Pi+2NAD+2CH3COCOOH+2ATP+2NADH 所生成的丙酮酸，在不同微生物体内，不同条件下，生成不同的代谢产物。,2019,糖原（或淀粉）,1-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖,6-磷酸果糖,1，6-二磷酸果糖,3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮,21，3-二磷酸甘油酸,23-磷酸甘油酸,22-磷酸甘油酸,2磷酸烯醇丙酮酸,2丙酮酸,葡萄糖,a,b,c,规律：主要通过调节反应途径中几种酶的活性来控制整个途径的速度，通过酶的变构效应实现活性的调节。,4.1.2 EMP途径的调节,2019,糖酵解调节机制-能荷调节,糖酵解调节点主要是三个激酶：己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶，所催化的三个反应是不可逆的，只参与糖酵解，不参与糖的新生。而激酶的活性是受细胞能荷调节的。为从数量上表示细胞内三种腺嘌呤核苷酸的能量情况，1968年Atkinson和Walton提出了能荷概念： 能荷是细胞中高能磷酸状态一种数量上的衡量，它的大小可用下式表示： 能荷=(ATP)+1/2(ADP)/(ATP)+(ADP)+(AMP),2019,(ATP)+1/2(ADP)/(ATP)+(ADP)+(AMP) 当体系中ATP含量高时，ATP抑制磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶的活性，使糖酵解减少。 当需要能量时，ATP分解为ADP、AMP，这样ATP减少，ADP增加、AMP增加能荷降低激酶活性增大； 无机磷也是调节者，它能解除6-磷酸葡萄糖对己糖激酶的抑制，加快糖酵解。 柠檬酸、脂肪酸和乙酰-CoA对糖酵解系统也有制动作用。,2019,4.1.3在无氧条件下丙酮酸的去路 在乳酸菌中，受乳酸脱氢酶作用，丙酮酸作为受氢体而被还原为乳酸，即为同型乳酸发酵； 在酵母中，丙酮酸脱羧生成乙醛，后者在乙醇脱氢酶作用下，乙醛为受氢体被还原成乙醇，即酒精发酵； 在梭状芽孢杆菌中，丙酮酸脱羧生成乙酰-CoA。然后经一系列变化生成丁酰-CoA、丁醛，两者作为客观存在氢体被还原为丁醇，生成物还有丙酮、乙醇、乙醇，称为丙酮丁醇发酵。,2019,4.1.4 HMP途径,除糖酵解及糖的有氧氧化代谢途径外，在细胞内还存在糖的其它分解途径。我们将这些途径称为分解代谢支路或旁路 单磷酸己糖途径 (hexose monophosphate pathway, HMP),也称磷酸戊糖途径( pentose phosphate pathway,PPP)是这些支路中较为重要的一种。 磷酸戊糖途径是指由葡萄糖生成磷酸戊糖及NADPH+H+，前者再进一步转变成3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖的反应过程,2019,过程,5-磷酸核糖,5-磷酸木酮糖,6-磷酸葡萄糖,糖酵解,6-磷酸葡萄糖酸,NADP+,NADPH+H+,5-磷酸核酮糖,NADP+,NADPH+H+,CO2,7-磷酸景天酮糖,3-磷酸甘油醛,6-磷酸果糖,4-磷酸赤藓糖,3-磷酸甘油醛,氧化阶段,非氧化阶段,6(6-磷酸葡萄糖)+6O2 6(5-磷酸核酮糖)+6CO2+6H2O+36ATP,葡萄糖+O2 6CO2+6H2O+30ATP(66-6(活化),3-磷酸甘油醛,6-磷酸果糖,2019,HMP途径总的反应式如下所示。 一份子葡萄糖经过HMP途径产生123-6=30 分子ATP 有氧条件下即可发生HMP反应,6-磷酸葡萄糖 + 12 NADP+ + 12 H2O,6CO2 +12 NADPH+12 H+ Pi,2019,4.1.5 丙酮酸的氧化脱羧,丙酮酸进入线粒体，氧化脱羧形成乙酰CoA (acetyl CoA)。,总反应式:,葡萄糖,EMP,2019,4.1.6 糖的有氧氧化,2019,三羧酸循环(Tricarboxylic acid Cycle, TCA)也称为 柠檬酸循环，这是因为循环反应中的第一个中间产物 是一个含三个羧基的柠檬酸。由于Krebs在1937年正式 提出了三羧酸循环的学说，故此循环又称为Krebs循环。 所有的相关反应均在线粒体中进行。,三羧酸循环,在好氧真核生物线粒体基质中或好氧原核生物细胞质中，酵解产物丙酮酸脱羧、脱氢，彻底氧化为CO2、H2O并产生ATP的过程。,2019,NADH+H+,NAD+,NAD+,NADH+H+,GTP,GDP+Pi,FAD,FADH2,NADH+H+,NAD+,柠檬酸合酶,顺乌头酸酶,异柠檬酸脱氢酶,-酮戊二酸脱氢酶复合体,琥珀酰CoA合成酶,琥珀酸脱氢酶,延胡索酸酶,苹果酸脱氢酶,TCA循环,2019,a、总反应式: CH3COSCoA+3NAD+FAD+GDP+Pi+2H2O 2CO2+CoASH+3NADH+3H+ +FADH2+GTP,4.1.7 TCA反应阶段的反应方程式和化学计量关系,注意：现在有新的理论，计算结果差别较大。,2019,总计：38 ATP或36 ATP,1摩尔葡萄糖完全氧化产生的ATP数量,2019,是三大营养物质氧化分解的共同途径； 是三大营养物质代谢联系的枢纽； 为其它物质代谢提供小分子前体； 为呼吸链提供H+ + e。,4.1.8 三羧酸循环的生理意义,2019,糖类氨基酸核苷酸三大营养物质代谢关系,2019,异柠檬酸 脱氢酶,柠檬酸合酶,-酮戊二酸 脱氢酶复合体,柠檬酸,Ca2+, ATP、ADP的影响, 产物堆积引起抑制,循环中后续反应中间产物变构反馈抑制前面反应中的酶, 其他，如Ca2+可激活许多酶,Ca2+,4.1.9 TCA循环的调控,2019,乙酰CoA,柠檬酸,草酰乙酸,琥珀酸,-酮戊二酸,异柠檬酸,苹果酸,乙醛酸,4.1.10 乙醛酸循环,延胡索酸,乙酸,2019,丙酮酸,G,细胞液,柠檬酸,乙酰CoA,柠檬酸,草酰乙酸,-酮戊二酸,乙酰CoA,丙酮酸,线粒体,G-6-P,F-6-P,F-1.6-2P,磷酸果糖激酶,PEP,ADP+Pi ATP,ADP+Pi ATP,NADH,O2,ATP ADP+Pi,AMP + ATP 2ADP,Pi,Pi,PEP 羧激酶,己糖激酶,丙酮酸脱氢酶系,柠檬酸合成酶,-酮戊二酸 脱氢酶系,小结：EMP和TCA途径中的能荷调节,异柠檬酸 脱氢酶,异柠檬酸,2019,1860年，巴斯德发现，在厌氧条件下高速糖酵解的酵母若通入氧气，则葡萄糖消耗的速率急剧下降，厌氧酵解所积累的乳酸迅速消失，在这种缺氧的同时，葡萄糖消耗减，乳酸堆积终止的现象，称为巴斯德效应。 原因：在氧存在的情况下，氧化磷酸化使NADH的H+不再转给丙酮酸生成乳酸而是转给氧，并产生大量ATP。丙酮酸进入TCA循环使柠檬酸浓度增加，由于高含量的ATP和柠檬酸变构抑制磷酸果糖激酶的活性，从而减缓了糖酵解速度和TCA循环的速度。,4.1.11 巴斯德效应(Pastuer effect),2019,4.2.1 D- 核糖的主要用途 D- 核糖多用于合成VB2, VB2 广泛用于食品、饲料、制药和化妆品等行业; D-核糖还可用于合成IMP和GMP等食品香味促进剂 在医药工业中D- 核糖是合成类固醇、前列腺素类、维生素 的结构类似物、萜类化合物的初始原料,4.2 D-核糖发酵,2019,4.2.2 微生物发酵法生产D-核糖的历史与现状,1951 年Simonart 和 Godin首次报道了发酵法生产 D-核糖 1966 年, Saito 和 Sugiyama报道了食爬虫假单胞菌( Pseud monas reptilivora ) 在30 oC通气培养72 h 发酵液中能积累D-核糖 0.72 g/L。 1971 年, Sasajima 和 Yoneda报道了芽胞杆菌属细菌的转酮酶缺陷株在最适的发酵条件下, 发酵液中可积累D-核糖35 40 g/L。 1976 年，Sasajima 等人，不产芽孢的突变株, 70 g/ L 1990 年, 星野达雄等人， 枯草芽孢杆菌突变株，118. 8 g/ L 主要生产厂家：德国BASF，Merk;瑞士Hoffmann-La Roche; 美国Pfizer;日本Takeda化学工业株式会社,80 g/L,2019,5-磷酸核糖,5-磷酸木酮糖,6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖酸,5-磷酸核酮糖,7-磷酸景天酮糖,3-磷酸甘油醛,6-磷酸果糖,4-磷酸赤藓糖,3-磷酸甘油醛,(6-磷酸果糖),核糖,3-磷酸甘油醛,磷酸烯醇式丙酮酸,莽草醛,VK,COQ,phen-AA,4.2.3 D-核糖的生物合成路径和育种思路,核苷酸、辅酶,2019,1、出发菌株选择 芽孢杆菌属的细菌转酮酶缺陷突变株积累D-核糖具有普遍性。而E.coli、鼠伤寒沙门氏等细菌的转酮酸缺陷突变株并不积累核糖，因此多采用芽孢杆菌属细菌。,4.2.4 D-核糖发酵的代谢育种技术,2019,2、转酮酶缺陷突变株的分离（选育） 选育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突变株，因为D-葡萄糖酸和L-阿拉伯糖必须通过磷酸戌糖途径进行代谢，若转酮酶发生缺陷，那样菌体自然也就不能利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖。 选育莽草酸缺陷突变株 选育L-Trp-、L-Tyr-、L-Phe-、CoQ-、Vk-或Vm-、 4-磷酸赤藓糖营养缺陷型、 转酮酶缺陷型、转醛酶缺陷型。,2019,1989年,Kishimoto 选育到的短小芽孢杆菌产量达到92 g/L 1997 年邓崇亮等通过紫外线和甲基磺酸乙酯诱变选育莽草酸营养缺陷型菌株发酵 72 h 产核糖 55 g/L。 1999 年谢红等用紫外线照射筛选到一株草莽酸缺陷型枯草芽孢杆菌, 产D- 核糖42 g/L 以上,46.6 g/L,2019,3、其它标记 在维持转酮酶缺陷的情况下，进一步诱变使菌体带上具有高葡萄糖脱氢酶活性、高葡萄糖酸激酶和丧失孢子形成能力，可使D-核糖大量积累。,2019,小林等人将葡萄糖脱氢酶基因克隆到载体质粒PHY300PLK中，然后转化到枯草芽孢杆菌中去。构建扩增葡萄糖脱氢酶的D-核糖工程菌，350C发酵80 h可积累D-核糖49 g/L 。,4、利用基因工程技术构建D-核糖工程菌株,2019,发酵培养基： 碳源：葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麦芽糖、 乳糖、甘油、 糊精、可溶性淀粉等。 氮源：干酵母、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨 、玉米浆 、(NH4)2SO4 其他：磷酸盐，碳酸盐，适量微量元素。 要在好氧条件下，pH中性，温度37 0C 。,5、发酵控制,2019,D-核糖典型发酵过程曲线,2019,The comparation of the perform of B. subtilis SPK1 under different conditions (at the late-exponential phase). Dry cell mass, glucose, xylose, D-ribose, DO, pH, feed rate,46.6 g/L,23 g/L,2019,Optimized fed-batch fermentation of B. subtilis SPK1were 2.0 and 1.2-fold higher than the corresponding values in a simple batch fermentation.,2019,4.3 柠檬酸发酵,柠檬酸化学名称2-羟基丙三羧酸，英文名citric acid，分子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。,2019,4.3.1 柠檬酸合成途径的发现,1893年，C. Wehmer发现Penicillium能积累柠檬酸 1913年，Currie发现黑曲霉能在高浓度糖上合成柠檬酸 1940年，Krebs发现 TCA过程； 1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶； 1954年，Shu提出葡萄糖分解代谢中经80% 走EMP途径； 1954-1955年，Ramakrishman和Martin发现黑曲霉中存在 TCA循环。 1958年,Medomough发现黑曲霉还存在着HMP途径的酶， 但HMP途径主要存在与孢子形成阶段。,2019,大多数微生物在代谢过程中都能合成柠檬酸，正常生理状况下很少积累柠檬酸。 工业生产几乎都是用黑曲 霉作为生产菌，黑曲霉产酸量高，转化率也高。且能利用多种碳源，因而是柠檬酸生产的最好菌种。 用石油副产品为原料生产柠檬酸，主要以假丝酵 母属为生产菌种，其次是毕赤酵母、球拟酵母、 汉逊氏酵母和红酵母属的一些种。,2019,4.3.2 行业简介,目前，我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一，从技术上，在国际上也是处于世界领先水平，并领先于其他国家.,2019,2019,乙酰CoA,柠檬酸,草酰乙酸,琥珀酸,-酮戊二酸,异柠檬酸,苹果酸,乙醛酸,4.3.3柠檬酸生物合成途径,延胡索酸,乙酰CoA,丙酮酸,葡萄糖,EMP,2019,葡萄糖经由EMP途径生物合成柠檬酸时，葡萄糖分子经过碳架断裂及重组，但没有碳原子损失，理论转化率106.7%。 2C6H12O6+3O2-2C6H8O7+4H2O 葡萄糖经由HMP途径生物合成柠檬酸时，葡萄糖损失1个碳原子，理论转化率88.9 %。,2019,乙酰CoA,柠檬酸,草酰乙酸,琥珀酸,-酮戊二酸,异柠檬酸,苹果酸,乙醛酸,柠檬酸合成酶 磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶 丙酮酸羧化酶 乌头酸酶 异柠檬酸脱氢酶 异柠檬酸裂解酶,4.3.4柠檬酸 发酵机制,延胡索酸,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰CoA,葡萄糖,CO2,2019,4.3.9 柠檬酸发酵的代谢控制育种 1、出发菌株的选择 2、选择透明圈大的突变株。 如：平板：10%甘薯 + 2%的琼脂 + 0.5% CaCO3 3、选择变色圈大的突变株。 如： 平板：麦汁培养基 + pH值指示剂（溴酚蓝pH=3.0时呈黄色，pH=4.6时呈蓝紫色 ），菌株诱变后，33培养3天，变色圈大的则好。,2019,4、选择耐高渗透压的突变株 高浓度糖（16-25%甘薯粉）和高浓度柠檬酸（培养基中含量10-20%）的培养基中能生长