课件：第一组项目四用弗化柠檬酸菌酶法合成酪氨酸.ppt

项目四 用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸,组别：第一组 组员：丁玉琴 郜东亚 卞如华 王艺颖 许园园 傅慧 指导老师：彭老师 韦老师,任务1 酶法合成L-酪氨酸方案的制定及实训准备 任务2 弗氏柠檬酸菌的培养及破碎 任务3 酪氨酸酚裂解酶的活力测定 任务4 用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸 任务5 酶法合成产物L-酪氨酸的分析鉴定,2019,-,1,目录,酪氨酸酚裂解酶的活力测定,酶法合成产物L-酪氨酸的分析鉴定,用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸,弗氏柠檬酸菌的培养及破碎,基 础 知 识,2019,-,2,中文名称:L-酪氨酸 中文别名:L-对羟苯基-丙氨酸;(2S,3R)-2-氨基-3-对羟苯基丙酸 英文名称:L-Tyrosine L-酪氨酸属氨基酸的一种，结晶性粉末，从酪蛋白或玉米等含蛋白质物质的水解液中提取，是人体非必需氨基酸。医药上用作治疗甲状腺功能亢进，也可做为食品添加剂。,基础知识,2019,-,3,基础知识,L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸是近年 来氨基酸工业的研究热点之一。 酪氨酸酚裂解酶( tyrosine phenol-lyase，TPL，EC 4 1 992) ，也称-酪氨酸酶，在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸，而L-酪氨酸常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸，以及L-多巴、黑色素、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料。,2019,-,4,基础知识,超声波细胞破碎仪又名超声微波协同萃取仪，超声波细胞裂解仪，超声波纳米材料粉碎机。超声波细胞破碎仪由超声波发生器和换能器两大部分组成（有的配置有隔音箱）。,2019,-,5,基础知识,超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它是一种波动形式，因此它可以用于探测人体的生理及病理信息，既诊断超声。同时，它又是一种能量形式，当达到一定剂量的超声在生物体内传播时，通过它们之间的相互作用,能引起生物体的功能和结构发生变化，即超声生物效应。超声对细胞的作用主要有热效应，空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高热（42-43），因为正常组织的临界致死温度为45.7，而肿瘤组织比正常组织敏感性高，故在此温度下肿瘤细胞的代谢发生障碍，DNA、RNA、蛋白质合成受到影响，从而杀伤癌细胞而正常组织不受影响。空化效应是在超声照射下，生物体内形成空泡，随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡，使肿瘤出血、组织瓦解以致坏死。,2019,-,6,弗氏柠檬酸菌的培养及破碎,柠檬酸杆菌属拉丁学名(Citrobacter Werkman and Gillen，1932) 直杆菌、直径约1.0，长2.06.0 m，单个和成对。与肠杆菌科的一般定义相符。通常不产生荚膜。革兰氏阴性，通常以周生鞭毛运动。兼性厌氧。有呼吸和发酵两种类型的代谢。在普通肉胨琼脂上的菌落一般直径24mm，光滑、低凸、湿润、半透明或不透明，灰色，表面有光泽，边缘整齐。偶尔可见粘液或粗糙型。,2019,-,7,氧化酶阴性。接触酶阳性。化能有机营养，能利用柠檬酸盐作为惟一碳源。硝酸盐还原到亚硝酸盐。没有赖氨酸脱羧酶。不产生苯丙氨酸脱氨酶、明胶酶、脂肪酶和DNA酶。不分解藻朊酸盐和果胶酸盐。发酵葡萄糖产酸产气。甲基红试验阳性。VP试验阳性。见于人和动物的粪便，或许是正常肠道栖居菌。时常作为条件致病菌分离自临床样品。也见于土壤、水、污水和食物中。,2019,-,8,实验材料 （1）菌株 弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii） （2）试剂 LB培养基 配方：酵母提取物 5g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂 1520g 水 1000mL pH 7.47.6,2019,-,9,实训步骤 （1）菌种培养 配制培养基 菌种活化 待灭菌后的固体培养基冷却至50时，倒入平板中（大约每皿15ml），待平板凝固后，挑取菌种进行划线接种。接种好的平板倒置放于培养箱，37培养24h。,2019,-,10,扩大培养 挑取上面培养好的菌落，放入已灭菌好的液体培养基的三角瓶中进行扩大培养。37、200r/min摇床过夜培养。（培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多） （2）破碎细胞 菌体收集 取已经培养过夜的弗氏柠檬酸菌菌悬液于离心管中，3000r/min 离心5min，弃上清液，收集菌体。,2019,-,11,细胞破碎 向离心后的沉淀中加入Tris-HCL（PBS）缓冲液（1:20），在漩涡混合器混合。然后再超声破碎仪下破碎，功率和时间根据菌液多少确定。功率不得太高，不要起气泡。循环次数不要太多，运行2s，间歇6s。冰上破碎效果更佳，菌液破碎铅为乳白色，破碎后为透明。 收集破碎液 将破碎好的液体倒入离心管中离心，3000r/min离心5min。弃沉淀，上清液备用。,2019,-,12,酪氨酸酚裂解酶的活力测定,福林酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。,2019,-,13,用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸,L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，收率低，环境污染严重，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸具有重要的应用价值。用TPL合成L-酪氨酸，首先开展的工艺是丙酮酸路线。,2019,-,14,Para等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的Cintermiedius固定化细胞作为催化剂，分批添加底物，建立75mmol/L丙酮酸钠、45mmol/L硫酸铵、45mmol/L氯化铵和55mmol/L苯酚的转化体系，反应5h后可积累L-酪氨酸10g/L。若将反应体系置于连续的柱反应器内，苯酚对L-酪氨酸的转化率达90%，且稳定性可维持5d。,2019,-,15,酶法合成产物L-酪氨酸的分析鉴定,实训原理 纸层析法是利用各物质不同的分配系数，使混合物 随流动相时而得到分离的方法。 纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的。滤纸纤维与 水亲和力较强，而与有机溶剂亲和力弱，所以纸层 析以滤纸纤维和结合水为固定相，以有机溶剂为流 动相。当有机相沿滤纸流动经过样品点时，样品点 上的溶液在水相和有机相之间进行分配，样品移动 速率与样品的极性及水亲和力有关，因此，极性氨基酸移动较慢，而非极性氨基酸移动较快。,2019,-,16,溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示： Rf =原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离= X/Y 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。 Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。,2019,-,17,实训器材及试剂 （1）层析缸 （2）毛细管：5只/组。 （3）培养皿：1只/组。 （4）层析滤纸（长16cm、宽16cm的）：1张/组。 （5）直尺、铅笔：自备。 （6）电吹风：1只/组。 （7）针、白线：1套/组。 （8）小试管：4只/组 （9） 移液管等常规仪器 （10）喷雾器,2019,-,18,1.展层剂和平衡液 正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展层剂；下层液作平衡液(弃去)。 2. 样品液 用水配成每ml含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml的氨基酸溶液，以及上述四种氨基酸的混合液(各4mg/ml)。 3. 茚三酮 按展层剂0.25%的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解。,2019,-,19,实训操作 （1）检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120烘干。 （2）规划：取宽约16cm、高约16cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位）。,2019,-,20,（3）点样：在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号(混合样可写M)，然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点第二次。前三种氨基酸各点3次，混合液点6次。将点过样的滤纸用针线卷成筒状（点样面向内），注意纸的两边不能接触，留一定缝隙。,2019,-,21,（4）层析：将培养皿中放入2/3量的展层剂，迅速放置于层析缸中。把滤纸筒转移到此培养皿内，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点。当溶剂前沿到达滤纸2/3处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿。 注意：点样端朝下，点样处不能没 入层析液中，滤纸不能贴壁 （5）显色：热风吹干滤纸至显出氨基酸斑点，用铅笔描出轮廓。,2019,-,22,后面内容直接删除就行