课件：第八章特殊毒性及其试验与评价方法.ppt

,一、致癌作用的概念 二、致癌作用的发生过程 三、致癌试验设计 四、致癌作用评价,第三节 致癌作用及其试验与评价方法,一、致癌作用的概念,致癌作用是指环境有害因素引起或增进正常细胞发生恶性转化并发展为肿瘤的过程。 化学致癌(chemical carcinogenesis)是指化学物质引起正常细胞发生恶性转化并发展成肿瘤的过程，具有这种作用的化学物质称为化学致癌物(chemical carcinogen)。,癌症的发生8090由环境因素引起，包括物理因素、生物因素和化学因素。其中主要是化学因素。 在环境因素引起的肿瘤中，80以上由化学因素引起。,致癌物可分为三大类：遗传毒性致癌物、无机致癌物和非遗传毒性致癌物。,1、遗传毒性致癌物 （1）直接致癌物：不需代谢活化直接与亲核分子共价结合形成加合物。这类化合物为亲电子剂，大多数为合成有机物。 内酯类，如-丙烯内酯等；烯化环氧化物；亚胺类；芥子气和氮芥；活性卤代烃类等。,多数有机致癌物本身并不致癌，需代谢活化才具有致癌活性，称为间接致癌物。间接致癌物的原型称为前致癌物。前致癌物经代谢活化形成的中间间代谢产物近致癌物（半致癌物），有一定致癌作用但必须再一次激活终致癌物（前致癌物经代谢活动形成的具有致癌作用的代谢物和不需代谢活化的致癌物）。,（2）前致癌物,2. 无机致癌物 放射性元素和重金属。有些可能是亲电子剂，但有些是通过选择性改变DNA复制保真性，导致DNA的改变。 铀、镭、氡等可能由于其放射性致癌。 镍、铬、钛、锰等金属及其盐类可在一定条件下致癌。,3. 非遗传毒性致癌物(non-genotoxic carcinogens) 非遗传毒性致癌物不与DNA反应，可能间接地影响DNA并改变基因组导致细胞癌变，或者通过促长作用、增强作用导致癌的发展。,（1）促癌剂：本身无致癌性，在给以遗传毒性致癌物之后再给以促长剂可增强遗传毒性致癌物的致癌作用，也可促进“自发性”转化细胞发展成癌。 如苯巴比妥对大鼠肝癌有促进作用；色氨酸和糖精对膀胱癌有促癌作用。,（2）细胞毒物：可能引起细胞死亡，导致细胞增殖活跃及癌发展。 如氮川三乙酸使锌进入肾脏，由于锌的毒性，造成细胞死亡，结果引起增生和肾肿瘤。,（3）激素调控剂：主要改变内分泌系统平衡及细胞正常分化，常起促长剂作用。 （4） 免疫抑制剂：主要对病毒诱导的恶性转化起增强作用。 如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤等免疫抑制剂或免疫血清，均能使动物和人发生白血病或淋巴瘤，但很少发生实体肿瘤。,（5） 固态物质：物理状态是关键性因素，可能涉及细胞毒性。如塑料、石棉等。 动物皮下包埋塑料后，经过较长的潜伏期，可导致肉瘤形成。石棉在人和动物的胸膜表面可引起胸膜间皮瘤。石棉和其它矿物粉尘，如铀矿或赤铁矿粉尘，可增强吸烟致肺癌的作用。,（6）过氧化物酶体增殖剂：过氧化物酶体增殖可导致细胞内氧自由基过量生成。 如降血脂药安妥明、降脂异丙酯、增塑剂邻苯二甲酸酯和有机溶剂1，1，2-三氯乙烯。,（7）助癌物：本身无致癌性，在致癌物之前或同时应用助癌物可显著增加癌症的发生。 助癌作用的机制可涉及增加致癌物的吸收、增加活化的致癌物的比例、耗尽内源性结合反应底物、抑制DNA修复、促进DNA损伤固定为突变等。,（二）按致癌作用证据分类,组1，对人类是致癌物。对人类致癌性证据充分者属于本组。对人的致癌性证据尚不充分，但对实验动物的致癌证据足够，并且具有可通过相关致癌机制对人体发挥作用的强有力证据，可归为此类。 如黄曲霉毒素、砒霜、石棉、六价铬、二恶英、甲醛、酒精饮料、烟草、槟榔等。,组2，对人类是很可能或可能致癌物。又分为两组，即组2A和组2B。 组2A，对人类很可能(probably)是致癌物。指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分。 对人体致癌的可能性较高的物质或混合物，在动物实验中发现充分的致癌性证据。对人体虽有理论上的致癌性，而实验性的证据有限。 如丙烯酰胺、无机铅化合物、氯霉素等。,组2B，对人类是可能(possible)致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据并不充分；或指对人类致癌性证据不足，对实验动物致癌性证据充分。 如氯仿、DDT、敌敌畏、萘卫生球、镍金属、硝基苯、柴油燃料、汽油等。,组3，对人类的致癌性尚不能确定。指对人类致癌性证据不充分，对实验动物致癌性也不充分或有限。或人类致癌性证据不充分，对实验动物致癌性证据足够，但有强有力的证据表明动物致癌机制不适用人体。如苯胺、苏丹红、咖啡因、二甲苯、糖精及其盐、安定、氧化铁、有机铅化合物、静电磁场、三聚氰胺、汞与其无机化合物等。 组4，对人类可能是非致癌物。指证据指示对人类和动物不具有致癌性。,二、致癌作用的发生过程,肿瘤的发生是一个长期的、多阶段、多基因改变累积的过程，具有多基因控制和多因素调节的复杂性。,1、持续性增殖，分化不良，体外培养无接触性抑制。永生性。 2、浸润性生长：可侵入其他组织，并发生转移 3、过分旺盛地合成核酸和氨基酸 4、强烈的有氧酵解：在供氧充分时，仍能将葡萄糖转化为乳酸，大量的乳酸使pH下降，影响细胞酶活力，破坏内稳态的维持。 5、可将上述特征遗传给子代细胞。,癌细胞的生物学特点,癌细胞大小不等。胞浆着蓝色，边缘有少许细小紫红色颗粒，含空泡。核型不规则，染色质粗点状排列。核仁明显，多少不一，有空泡，此外可见裸核细胞。右上瘤细胞有血小板附着。,尚未彻底阐明，大体可分为遗传机制学说和非遗传机制学说。,1、化学致癌的多阶段学说 （1）启动阶段：化学致癌的第一阶段，致癌物对靶细胞DNA产生损伤作用，经细胞分裂增殖固定下来，造成单个或少量细胞发生永久性、不可逆的遗传性改变。,二、致癌作用的发生过程,具有引发作用的化学物称为引发剂。引发剂本身有致癌性，大多数是致突变物，没有可检测的阈剂量，引发作用是不可逆的并且是累积性的。但并非所有的引发细胞都将构成肿瘤，因其中大多数将经历程序性细胞死亡（凋亡）。引发细胞不具有生长自主性，因此不是肿瘤细胞。,（2）促长阶段 促长阶段是引发细胞增殖成为癌前病变或良性肿瘤的过程。促长剂单独使用不具致癌性，必须在引发剂后使用才发挥促长作用。 促长剂通常是非致突变物，影响引发细胞的增殖，导致局部增殖并引起良性局灶性病理损害，如乳头瘤、结节或息肉。这些病损很多会消退，仅少数细胞发生进一步突变形成恶性肿瘤。,特点： 历时较长，早期有可逆性，晚期为不可逆的； 对生理因素调节的敏感性，衰老、饮食和激素可影响促长作用。,（3）进展阶段 进展阶段是从引发细胞群（癌前病变、良性肿瘤）转变成恶性肿瘤的过程。 在促进之中或之后，细胞表现出不可逆的遗传学改变，其标志为遗传不稳定性增加和恶性变化，在形态上或功能代谢和行为方面逐渐表现出肿瘤的特征，如生长速度、侵袭性、转移能力及生化、免疫性能改变。,使细胞由促长阶段进入进展阶段的化学物称为进展剂(progressor)。进展剂可引起染色体畸变，但不一定具有引发活性。,引发、促长及进展都可自发发生。有些化学致癌物可同时具有引发、促长及进展的作用，称为完全致癌物。,分化 程度 高 低,在引发阶段主要是细胞原癌基因和肿瘤抑制基因的突变； 在促长阶段主要是遗传外机制； 在进展阶段主要是核型不稳定性。 正常细胞经过遗传学改变的积累才能转变为癌细胞。,回主目录,返回,下一内容,返回,下一内容,回主目录,外源化学物,与人体接 触包括各 种途径,非遗传毒 性化学物,直接或间接诱导 有丝分裂、促进 细胞过度增殖,引发细胞,绝大多数经代谢解毒,排泄,少数经代谢活化,终致癌物,作用于生 物大分子,DNA加合物形成、癌基因与抑癌基因的改变,直接致癌物,癌前病变,肿瘤,逃避宿主的免疫监视,促癌物,DNA损伤修复,多阶段致癌 理论图解,正常上皮,结肠癌的多阶段模型,上皮过度增殖,早期腺瘤,中期腺瘤,晚期腺瘤,原位癌,浸润转移,引发阶段,促长阶段,进展阶段,由抑癌基因APC丢失开始，癌基因Ras突变促进克隆的发展，导致腺瘤发生。,抑癌基因DCC和p53缺失，促进结肠肿瘤从良性到恶性发展。,2、化学致癌的癌基因学说 调控细胞增殖和分化的基因发生异常，可导致细胞持续增殖，不能及时分化和凋亡，形成肿瘤。与细胞恶性转化有关的基因主要有癌基因和肿瘤抑制基因。,癌基因：能引起细胞恶性转化及癌变的基因。通常以原癌基因的形式存在正常动物细胞的基因组中。 原癌基因：正常细胞中的原癌基因表达并不引起恶性病变，其表达受到严格控制，通常与机体的生长和发育有关。原癌基因必须经过激活才能导致细胞的恶性转化。原癌基因是一种显性基因，当其两个等位基因之一发生突变，即可被激活。,原癌基因,癌基因,突变,致癌物,癌变,原癌基因与癌基因关系示意图,化学、物理或生物等致癌因素作用于细胞后，引起原癌基因突变并使之激活，转变成癌基因后才会导致细胞癌变。,肿瘤抑制基因：即抗癌基因。抗癌基因可能是编码抑制生殖、促进分化的基因，也可能是某些基因的负控制调节基因，并是维持基因组织定性的某些基因。,抑癌基因失活,肿瘤细胞增殖失控,化学致癌多基因、多因素参与的多阶段理论,化学致癌物,外源性因素 理化生物因素、营养等,内源性因素 遗传、免疫、激素、精神等,生物体,引起癌基因、抑癌基因等发生点突变、扩增、易位、重排、缺失等使癌基因活化，抑癌基因失活，导致细胞的增殖、分化、凋亡异常引起肿瘤。,1. 哺乳动物致癌试验 哺乳动物致癌试验是鉴定化学致癌物的标准体内试验。 哺乳动物致癌试验用来确定受试物对实验动物的致癌性、剂量-反应关系及诱发肿瘤的靶器官。,三、致癌试验设计,在下列情况下，一般应考虑进行致癌性评价： 人体可能长期暴露于该化学物； 该化学物或其代谢物的化学结构与已知致癌物相似； 反复染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变。,又称哺乳动物终生试验，是目前公认的确证动物致癌物的经典方法。 化学致癌的最大特点是潜伏期长，在啮齿类动物进行12年的试验即相当于人类大半生的时间。 如果采用流行病学调查方法确证一种新化学物的致癌性，一般需要人类接触受试物20年后才能进行。,（1）哺乳动物长期致癌试验,实验动物 物种和品系：要求用两种实验动物，常规选用大鼠和小鼠，也可用仓鼠。 在选择品系时应选择较敏感、自发肿瘤率低、生活力强及寿命较长的品系。,动物种属的选择，应考虑受试物可能作用的靶器官。 大鼠 肝癌 小鼠 呼吸道和肺肿瘤 金黄仓鼠、狗或猴 膀胱癌 靶器官无法估计 大鼠和小鼠,性别：应使用同等数量的雌雄两种性别的动物。 年龄：使用刚离乳的动物，以保证有足够长的染毒和发生癌症的时间，而且幼年动物解毒酶及免疫系统尚未完善，对致癌作用比较敏感。,动物数量 为避免假阴性，每组实验动物较一般毒性试验多。 每组至少有雌雄各50只动物，希望在出现第一个肿瘤时，每组还有不少于25只动物。,致癌试验一般设三个试验组。 高剂量组：为最大耐受剂量(MTD)是由亚慢性毒性试验来确定的，此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10，并且不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤。 低剂量组：一般不低于高剂量的10。最好相当于或低于人类实际接触的剂量，应不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。,剂量设置,中剂量组：介于高、低剂量之间（高剂量的1/31/4），如有可能按受试物的毒物动力学性质来确定。 对照组除不给受试物外，其他条件均与试验组相同。 同时应设阴性（溶剂或赋形剂）对照组。必要时可设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试物的化学结构相近。,试验期限 一般情况下，试验期限小鼠和仓鼠应为18个月，大鼠为24个月；然而对于某些生命期较长或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可持续24个月，大鼠可持续30个月。,染毒途径 尽可能模拟人体可能的暴露途径，主要途径有经口、经皮和吸入三种，应根据受试物的理化性质和接触方式选择确定。 受试物优先选择短期致癌试验阳性的化学物质。,（1）一般观察：每天观察受试动物一次，主要观察其外表、活动、摄食情况等。在实验最初三个月每周称体重一次，以后每两周称体重一次。经饲料或饮水给以受试物时，应记录食物消耗量或饮水量，以计算受试物的摄入量。观察时要注意有无肿瘤出现、肿瘤出现时间及死亡时间。,观察指标,（2）肿瘤发生情况 记录肉眼可见或可触及肿瘤出现的时间、部位、大小、外形、发展状况并记录动物死亡时间。,（3）病理检查 动物自然死亡或处死后必须及时进行病理检查，包括肉眼和组织切片检查。组织切片检查应包括已出现肿瘤或可疑肿瘤的器官和肉眼检查有明显病变的器官，应注意观察癌前病变。通过病理检查确定肿瘤的性质和靶器官。,统计各种肿瘤的数量（包括良性和恶性肿瘤）及任何少见的肿瘤、患肿瘤的动物数、每只动物的肿瘤数及肿瘤潜伏期。 肿瘤发生率（）（实验结束时患肿瘤动物总数/有效动物总数）100 式中，有效动物总数指最早发现肿瘤时存活动物总数。,结果分析,肿瘤潜伏期即从摄入受试物起到发现肿瘤的时间，因为内脏肿瘤不易觉察，通常将肿瘤引起该动物死亡的时间定为发生肿瘤的时间。 肿瘤多发性指一个动物出现多个器官的肿瘤或一个器官出现多个肿瘤。,应着重报告发现肿瘤的部位、数量、性质、癌前病变，以及其他毒性效应； 应报告剂量-反应关系及统计学分析结果。 如在动物组织中观察到良性和恶性肿瘤，并有良性肿瘤向恶性化进展的证据，在进行统计学分析之前将良性和恶性肿瘤合并是适宜的，但仍希望分别对良性和恶性肿瘤分别进行统计学处理。,结果报告：,致癌试验阳性的判定标准为WHO提出的标准。WHO(1969)提出机体可以对致癌物有下列一种或多种反应： （1）对于对照组也出现的一种或数种肿瘤，试验组肿瘤发生率增加； （2）试验组发生对照组没有的肿瘤类型； （3）试验组肿瘤发生早于对照组； （4）与对照组比较，试验组每个动物的平均肿瘤数增加。,在进行试验的两个物种两种性别动物中，有一种结果为阳性，即认为该受试物有致癌性。两个物种两种性别动物试验结果均为阴性时，方能认为未观察到致癌作用。,（2）哺乳动物短期致癌试验 哺乳动物短期致癌试验又称为有限体内试验，指时间有限（数月），靶器官有限。 较受重视的短期致癌试验有下列四种：小鼠皮肤肿瘤诱发试验、小鼠肺肿瘤诱发试验、大鼠肝转化灶诱发试验、雌性大鼠乳腺癌诱发试验。,小鼠皮肤肿瘤诱发试验 于小鼠皮肤局部连续涂抹受试物，以观察皮肤乳头瘤和癌的发生，一般20周可结束实验，较敏感的小鼠为SENCAR小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。 典型的引发剂为致癌性多环芳烃，促长剂为佛波醇酯(TPA)。,小鼠肺肿瘤诱发试验 染毒途径常用腹腔注射，也可灌胃或吸入，一般1630周可结束实验，观察肺肿瘤的发生。较敏感的小鼠为A系小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。 典型的引发剂为乌拉坦（抗肿瘤药物），促长剂为二丁基经基甲苯(BHT)。,大鼠肝转化灶诱发试验 对大鼠进行肝大部切除术后，给以受试物，一般可在814周结束实验，观察肝转化灶生成。肝转化灶是癌前病变，有-谷氨酰转肽酶活性升高，G6P酶和ATP酶活性降低，以及铁摄取能力降低。转化灶可用组织化学或免疫化学方法鉴定。 此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。 典型的引发剂为二乙基亚硝胺(DEN)，促长剂为苯巴比妥(PB)。,雌性大鼠乳腺癌诱发试验 一般可用SD大鼠（或Wistar大鼠），实验周期为6个月。多环烃芳香胺、氯烷、亚硝基脲等能在9个月以内诱发乳腺癌。 此四个试验不是成组试验，应根据受试物的特点选择使用。此四个试验任一试验得到阳性结果的意义与长期动物致癌试验相似，但阴性结果并不能排除受试物的致癌性。,致突变试验主要是对致癌物的筛选，其依据是化学物的致突变性与致癌性相联系，即大多数化学致癌物具有致突变性，而大多数非致癌物无致突变性。 利用致突变试验进行致癌物的筛查的毒理学意义是可检出基因遗传毒性的致癌物。 局限性：无法检出非遗传毒物的致癌性（假阴性）和具有遗传毒性的非致癌物（假阳性）。,（三）致突变试验,致突变试验用于致癌物筛选的短期试验如下： 基因突变试验：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)，培养哺乳动物细胞TK或HPRT正向突变试验； 染色体畸变试验：体外细胞系细胞遗传学分析，小鼠骨髓微核试验，大鼠骨髓染色体畸变试验； 原发性DNA损伤：DNA加合物，链断裂，DNA修复诱导（细菌SOS反应，大鼠肝UDS诱导），姐妹染色单体交换试验（SCE）； 体外细胞转化：叙利亚地鼠胚胎细胞，Balb/c 3T3细胞。,细胞转化是指受试物与正常细胞在体外接触，如有致癌作用，可使正常细胞形态、功能发生变化，发生与癌细胞相似的过程。 试验的目的是了解体外培养细胞接触受试物后，细胞生长是否发生癌变，其观察内容包括生长自控能力、细胞形态、细胞生长能力、生化表型以及移植于动物体内形成肿瘤的能力等。,（四）细胞转化试验,原理：癌细胞与正常细胞的不同是其核型的改变和因此而导致的生长自控能力的丧失。 细胞自控能力丧失可能导致细胞在离体培养时生长特性改变。,正常细胞：在液体培养时，克隆中的细胞排列有序、只能生长成单层； 癌细胞：贴壁生长的克隆失去接触抑制的能力，因而形成的“恶性转化”克隆中的细胞排列杂乱，重叠生长。 判断是否出现了细胞的恶变，须将转化的细胞植入试验动物体内，观察转化的细胞是否可发展成肿瘤。,恶变的细胞表现,细胞偏大，且大小不等； 核大而畸形，染色质深染而粗糙，核浆比例倒置，核膜粗厚，核仁增生而肥大； 核仁核胞浆因RNA增多而偏酸性，呈嗜碱性染色而偏蓝； 多见核分裂现象； 正常的接触抑制消失，它的克隆是多层细胞且排列紊乱； 生长表型改变。,常用的细胞种类,细胞选择的主要原则： 1、体外容易培养和传代，阴性细胞克隆背景较低； 2、细胞自发突变率低，或自发转化能力很弱； 3、已获得无限生长能力，但仍保持接触抑制而无致肿瘤性。,有三类细胞可应用于细胞转化试验： 原代细胞，如叙利亚仓鼠胚胎细胞（SHE细胞）、人类成纤维细胞、小鼠皮肤或大鼠支气管上皮细胞等； 细胞系，常用细胞系BAIJB/C-3T2，C3H10T1/2和BHK-1； 病毒感染细胞，如RLV/RE细胞（劳舍尔白血病病毒感染的Fisher大鼠胚胎细胞）和SA7/SHE细胞（猿猴腺病毒感染的SHE细胞）。,优点：试验周期短，经济方便；一个细胞克隆或细胞巢就相当于一只受试动物；受试物直接与靶细胞作用，便于控制剂量，不受吸收、代谢、分布的影响，并且可不受体内免疫系统等干扰；便于观察。 缺点：仍存在假阳性、假阴性等问题。,2. 转基因动物致癌检测模型 动物致癌试验耗时长，耗费人力物力大，使用的染毒剂量大。转基因底物为快速检测致癌物和促癌物提供了新的重要途径。 转基因小鼠可用于研究在致癌过程中特定基因的作用，可用于分析化学物-基因的相互作用。,（1）转癌基因小鼠 与转录启动子连接的癌基因转入后可直接在某些特定的组织中高效表达，使该组织细胞处于引发状态，这类转基因动物是研究化学物致癌作用的敏感体系。携带癌基因的转基因动物可用于致癌试验，试验周期仅3个月左右，有希望发展成代替长期动物致癌试验的试验系统。,这些携带有癌基因的转基因动物，可用来研究外源化学物与肿瘤相关基因的作用及外源化学物在致癌不同阶段中的作用机制。以各种组织特异性的促长剂处理转入不同癌基因的小鼠，可为致癌过程的研究提供新线索。,（2）肿瘤抑制基因敲除小鼠 在P53-/-小鼠，肿瘤(特别是淋巴肉瘤)的发生比正常小鼠(P53+/+)增加而且提前。由于P53-/-小鼠的肿瘤发生具有组织特异性，进一步研究这些肿瘤的遗传学基础有助于鉴定P53基因的功能。而半合子小鼠(P53+/-)在出生后6个月内自发癌发生率低，但在之后发生淋巴瘤和软组织肉瘤，其中大部分丢失P53野生型等位基因。这种小鼠对遗传毒性致癌物敏感性并不增加。这种半合子小鼠也可用于鉴定致癌过程中的协作基因。而且缺P53小鼠加速形成恶性肿瘤，提示此基因主要在进展阶段起作用。P53在肿瘤发生中的作用有待进一步研究。,（3）转穿梭质粒的转基因动物小鼠 转入带有报告基因的穿梭载体，是研究体内基因突变的转基因动物模型。 常用的靶基因如lacI、lacZ可通过噬菌体体外包装等方法，从小鼠基因组内回收，再在大肠杆菌内检测靶基因突变，可为研究不同器官基因的自发突变和诱发突变的分子机制提供有效的方法 。,动物致癌物的确定： 两种或两种以上种系的动物阳性； 一种种属但经两次或多次独立试验为阳性； 一种种属一次试验阳性，但发生率高，多个部位发生，出现罕见类型肿瘤、诱发肿瘤的时间短。,四、致癌物的最终确定,流行病学调查结果能够重复； 有剂量反应关系； 有动物致癌试验阳性结果支持。,人类致癌物的确定主要根据：,五、化学预防,化学预