冷冻切片方法及注意事项.doc

一、 实验前准备 清理实验台及仪器。 开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（- 15-20 *）。 准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。二、 取材 解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（24242mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。（注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性，应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过 3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。）三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（13分种）。 2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在510m间。 4、调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，以切出完整、平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带 ,可避免组织摊片过程中皱折 ,保证组织结构的完整及切片的美观。注：包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或 OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。）组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。冷冻箱及冷冻头的温度高低，要根据不同的组织而定。温度过低会导致组织块过硬,切片碎裂,出现梯田状薄厚不均或空洞;反之,温度过高,组织块硬度不够 ,切片不易成形或成皱褶。数据图1供参考。当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。四、 常用冰冻切片苏木精伊红染色染色步骤：1、冰冻切片用10%甲醛固定15分钟，流水冲洗2分钟，蒸馏水浸洗3分钟。2、苏木精12分钟。自来水快洗。3、0.5%盐酸乙醇分色12秒。蒸馏水快洗。4、0.25%0.5%氨水蓝化，几秒种或至组织变蓝，自来水洗30秒1分钟。光镜下检查细胞核分色程度。5、1%伊红1分钟。蒸馏水快洗。6、80%、90%、95%乙醇速洗，每级数秒到十几秒。光镜下监控细胞核与细胞质量颜色对比。7、100%乙醇2次，每次12分钟。8、二甲苯2次，每次12分钟。中性树胶封固。注：结束阶段的二甲苯作用为透明，其目的是增强标本的折光率，达到光镜下清晰观察染色结果。标本内若含水分可降低其折光率，导致光镜观察细微结构不清楚的结果。另二甲苯透明后有得于组织细胞的长久保存。HE染色的水洗：整个染色过程中共5处涉及到水洗，但其洗涤程度及作用均有所不同。 苏木精染色前的水洗为蒸馏水浸洗：切忌自来水替代蒸馏水浸洗，否则苏木精染液由弱酸性（棕红色）转变为弱碱性（蓝色），导致“有色沉淀”出现与积累，致使染色结果为黑蓝色。 苏木精染色后的水洗为自来水洗，伊红染色后的水洗为蒸馏水快洗，作用是洗去未与组织相结合的染料成分，即洗去“浮色”。伊红染液为水溶性溶液，浸洗时间长会使组织的伊红颜色减退。 分色后的水洗为自来水快洗，目的是终止分色液（0.5%盐酸乙醇）对组织细胞的分色作用。过度分色将致使染色强度减弱，影响苏木精与伊红颜色的匹配。 蓝化后的水洗为自来水冲洗，洗掉组织中多余的碱性成分（淡氨水），为伊红染色提供适宜的染色环境。五、冰冻切片的快速染色法 切片固定30秒1分钟。 水洗(10秒)。 染苏木素35分钟。自来水冲洗片刻。（在组织上加苏木精染液数滴,放在漂片机上的烤板上加热一分钟。染液不能干）分化(1%酸乙醇分化)。 于碱水(氨水)中返蓝20秒。 伊红染色1020秒。 脱水，透明，中性树胶封固。 注：固定液的选择A中性福尔马林溶液 B95%乙醇CAF(40%福尔马林10ml,95%乙醇90ml)DCarnoy(纯乙醇60ml,氯仿30ml,冰醋酸10ml)EClzrke改良液4(纯乙醇95ml,冰醋酸5ml)FBouin液(饱和苦味酸水溶液75ml,甲醛水溶液 25ml,冰醋酸5ml) 6种固定液固定后的组织切片染色效果各有差异,其中C 固定液固定的切片染色效果最好,组织结构清晰,核染色鲜艳,核无明显肿胀,核浆对比度好,镜下与石蜡切片相似(图1)。D 液、E 液、F 液染色效果均较好,结构较清晰, 核染色较鲜艳,但核有肿胀,核轮廓有些模糊。A 液染色效果较差,组织结构尚清楚,但细胞核肿胀比较明显且境界模糊不清(图2)。B 液染色效果差,核着色不良,结构模糊。甲醛、乙醇、冰醋酸、苦味酸对组织均有固定作用。甲醛对组织的穿透力强,对组织无明显收缩和膨胀作用,但它不能抵消因冷冻所引起的细胞内液体的膨胀,所以甲醛固定的组织结构尚完好,核有肿胀、模糊。乙醇对组织有脱水收缩作用,并可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白,但后者所产生沉淀可溶解于水,使核着色不良。冰醋酸对组织有明显的膨胀作用,加重了冷冻所引起的细胞内液体的膨胀,所以用含有冰醋酸的混合固定液(如D 液、E 液、F 液)固定的组织,核肿胀明显。F 液中虽然苦味酸对组织有明显的收缩作用,但有冰醋酸的存在仍然防止不了细胞的肿胀。本实验提示混合固定液对冷冻切片HE 染色的效果优于单纯固定液,但最好使用不含有冰醋酸的混合液。因此,推荐冷冻切片做HE 染色时首选AF 固定液。同时,其具有配制简单、使用方便的优点。六、 实验后打扫冷冻切片机使用结束后关闭电源,清洁腔体和擦干水气, 做好使用记录。 为让水蒸气蒸发，请不要马上关闭切片机的上盖移门，待过段时间再关。如需详细说明，请借阅说明书。七、主要试剂与溶液的配制1、10%甲醛甲醛水溶液（3040%）100mL，蒸馏水900mL。 价格便宜，对标本浸透快，不会产生过硬效果，可作为大标本的保存液，每隔3个月更换新液体，但可产生甲醛色素颗粒。2、10%中性甲醛10%甲醛水溶液1000mL，过量的碳酸钙（固体）沉积于底部，pH约为7.6。可避免其色素颗粒的形成。3、Harris苏木精苏木精2.5g，纯乙醇25mL，硫酸铝钾50g，蒸馏水500mL，氧化汞（或碘酸钠）1.25g，冰醋酸20mL。纯乙醇溶解苏木精，然后加入彻底溶解的钾明矾水溶液。分别加入氧化汞和冰醋酸，充分混合即可使用。冰醋酸的加入可以任意选择。4、1%伊红水溶液伊红Y10g，蒸馏水1000mL。混合，加入几粒麝香草酚结晶防止菌类的产生。 若组织细胞染色后伊红色度较浅，加入加入0.5mL稀释的醋酸水溶液到1000mL的伊红溶液内，提高其酸性，增强其色度。染色时间为15秒10分钟。细胞质、其内的嗜酸性物质以及胶原纤维等被染成鲜亮、清晰的红色或粉红色。伊红溶液的最佳染色pH为4.65.0。5、0.5%盐酸乙醇溶液浓盐酸0.5mL，70%乙醇100mL。 通常配制0%盐酸乙醇（70%）储备液备用，需要时稀释即可。6、0.5%氢氧化铵水溶液25%氢氧化铵0.5mL，自来水100mL. 由于氨成分易挥发，因此应随时留意溶液中的氨的浓度。石蜡切片的优点在于可以容易的存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保存 一贯很重要。冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。冰冻切片由于抗原性保存比较好，所以容易出阳性结果，但是组织结构形态的保存没有石蜡切片佳，而且抗原容易弥散，不易观察抗原分布情况。石蜡切片由于处理的原因，抗原常被封闭甚至破坏，需要抗原修复步骤，而且不一定能修复成功。表1不同温度下各种新鲜组织用冷冻切片结果组织名称冷冻头温度冷冻箱内温度结果肝肾脾淋巴结心脏- 10 - 12 - 15 - 20 - 15 - 15 - 20 - 25 无法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出现水平小裂痕消化管(食道 胃 肠管)- 10 - 15 - 20 - 25 - 15 - 20 - 25 - 30 无法成片成片不理想 ,欠挺真切片挺直 ,完整切片出现水平小裂痕大脑小脑- 15 - 20 - 23 - 30 - 20 - 25 - 28 - 35 无法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出现水平小裂痕腺体(唾液腺 乳腺甲状腺 前列腺)- 15 - 20 - 25 - 3