北京大学生物化学课件03.pptx

刘新文,北京大学医学部生物化学与分子生物学系,第二章 核酸化学,Nucleic Acids,第一节 概 述,核酸(nucleic acid) 以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。 DNA（Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸 RNA（Ribonucleic acid) 核糖核酸,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 1968年 Nirenberg发现遗传密码 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法 1985年 Mullis发明PCR 技术 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) 1994年 中国人类基因组计划启动 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,一、核酸的发现和研究工作进展,二、核酸的分类及分布、功能,(deoxyribonucleic acid, DNA),(ribonucleic acid, RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。,分布于胞核、胞液。,携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。,参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。,第二节 核酸的分子组成,一、元素组成,主要元素组成： C、H、O、N、P(911%),与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占9-11%。,二、基本构成单位：核苷酸(nucleotide),核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成,戊 糖,碱 基,胺式 亚胺式互变异构,酮式烯醇式互变异构,碱基的结构特征,嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（260 nm左右）。,核苷 nucleoside,糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。,核糖核苷：AR, GR, UR, CR 脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR,核苷酸(ribonucleotide)的结构与命名,核苷和磷酸以磷酸酯键连接,稀有核苷酸,修饰成分,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,2、稀有核苷酸：稀有碱基/核苷/核苷酸,3、核苷酸的其他形式,多磷酸核苷（NDP、NTP),环化核苷酸（cAMP、cGMP等）,辅酶或辅基（NAD、NADP、FAD、CoA等，均含有AMP），,活性代谢物（UDPG、CDP-胆碱，等）,1、核苷酸的组成：含氮碱基、戊糖和磷酸。,ATP的性质,ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。 ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。 ATP 也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,cAMP和cGMP,cAMP(3,5-环化腺苷酸)和cGMP(3,5-环化鸟苷酸)的主要功能是作为细胞的第二信使。 cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键。在pH7.4, cAMP和cGMP的水解能约为43.9 KJ/mol，比ATP水解能高得多。,第三节 核酸的分子结构,一、一级结构（primary structure）,一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。,1、核苷酸的连接方式： 3, 5磷酸二酯键,2、核酸的基本结构形式：多核苷酸链,信息量：4n 末端： 5 端、 3端 多核苷酸链的方向： 5端3端(由左至右),3、表示方法：结构式、线条式、文字缩写,碱基组成分析Chargaff 规则：A = T；G C,碱基的理化数据分析：A-T、G-C以氢键配对较合理,DNA纤维的X-线衍射图谱分析,DNA双螺旋结构的研究背景,二、DNA的空间结构,（一）DNA的二级结构（secondary structure）,1、碱基组成规则(Chargaff规则),A=T，G=C； A+G=T+C(嘌呤与嘧啶的总数相等),有种属特异性,无组织、器官特异性,不受年龄、营养、性别及其他环境等影响,DNA分子由两条DNA单链组成。 DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。 双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。,DNA双螺旋结构的特点,double helix model,DNA双螺旋结构的要点,（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5端3端，而另一条链的方向为3端5端。,（2）嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。,（3）螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈的高度）为3.4 nm。,（4）维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:A与T结合，G与C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。 在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,（5）螺旋表面形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)，彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。 （6）氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,（二）二级结构： 双螺旋结构模型(double helix model),1、Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA),（1）反平行双链：脱氧核糖-磷酸骨架位于外侧，碱基对位于内侧,（2）碱基互补配对：AT配对（两个氢键），GC配对（三个氢键）；碱基对平面垂直纵轴,（3）右手双螺旋：螺距为3.4 nm，直径为2.0 nm，10bp/圈,（4）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础,（5）维持结构稳定的力量：氢键维持双链横向稳定，碱基堆积力维持螺旋纵向稳定,3、其他螺旋形式,Z-DNA（左手双螺旋） A-DNA,DNA双螺旋的稳定性,DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。 维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键，碱基堆积力。 双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响； 介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力等。 改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。,天然存在的DNA分子最显著的特点是很长，分子质量很大，一般在1061010。 大肠杆菌染色体由400万碱基对(basepair，bp)组成的双螺旋DNA单分子。其长度为1.4106nm，相当于1.4mm，而直径为20nm，相当原子的大小。 黑腹果蝇最大染色体由6.2107bp组成，长2.1cm 多瘤病毒的DNA由5100bp组成 ，长1.7mm,（二）DNA的三级结构,双螺旋进一步扭曲,形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括：线状DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状DNA形成的结、超螺旋和连环等,大多数原核生物 ： 1）共价封闭的环状双螺旋分子 2）超螺旋结构：双螺旋基础上的螺旋化,正超螺旋(positive supercoil):盘绕方向与双螺旋方同相同 负超螺旋(negative supercoil):盘绕方向与双螺旋方向相反,（三）DNA在真核生物细胞核内的组装,核小体(nucleosome)： 由DNA和组蛋白构成。,DNA：以负超螺旋缠绕在组蛋白上,组蛋白核心：H2B ,H2A ,H3 ,H4,H1组蛋白在核小体之间,DNA的存在形式,（三）DNA的功能,DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。,三、RNA的分子结构,RNA的结构特点,RNA是单链分子，因此在RNA分子中，嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。 RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。 在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G 除了可以和C 配对外，也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA, 其二级结构有明显的差异。 tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分.,（一）信使RNA的结构与功能,* 真核生物mRNA的结构特点,1. 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2. 大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,内含子 (intron),外显子 (exon),* 真核生物mRNA成熟过程,mRNA核内向胞质的转位 mRNA的稳定性维系 翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,* mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,（二）tRNA的结构与功能,* tRNA的一级结构特点 含 1020% 稀有碱基，如 DHU 3末端为 - CCA-OH 5末端大多数为G 具有 TC,双氢尿嘧啶(DHU),假尿嘧啶(),次黄嘌呤(I),* tRNA的二级结构 三叶草形 氨基酸臂 DHU环 反密码环 额外环 TC环,氨基酸臂,额外环,* tRNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,1、分子较小，含较多的稀有碱基和非标准碱基配对,2、5端一般为鸟嘌呤核苷酸，3端为CCA-OH3。,3、二级结构为“三叶草”型（cloverleaf pattern）,小结,反密码环：反密码环中部的三个碱基可以与mRNA的三联体密码形成碱基互补配对，解读遗传密码，称为反密码子（anticodon）。I常出现于反密码子中,氨基酸臂：3末端的CCA-OH3单链用于连接该tRNA转运的氨基酸。,二氢尿嘧啶环（DHU）：识别氨酰-tRNA合成酶,TC环：识别核蛋白体（核糖体）,4、“倒L”型三级结构,（三）rRNA的结构与功能,核蛋白体的组成,* rRNA的功能:组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。,（四）其他小分子RNA及RNA组学,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs),或非编码蛋白质的RNA(non-coding RNA, ncRNA) 。,种类：核内小RNA；核仁小RNA；胞质小RNA；催化性小RNA；小片段干涉 RNA,功能：参与hnRNA和rRNA的加工和转运。ncRNA在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此，有人也将其称为调节RNA（regulatory RNA）。,小片段干扰RNA （siRNA；又称“引导RNAs”，guide RNAs）：一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi，也译作RNA干预或干涉）。它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。,RNAi的作用机制：包括起始阶段和效应阶段。（1）在起始步骤，生物宿主将外源基因表达的双链RNA进行切割，产生具有特定长度（19-21nt）和序列的小片段RNA； （2）在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA。,RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。,RNA组学:,第四节 核酸的理化性质,一、酸性化合物,两性解离，但酸性强 电泳行为泳向正极（pH7-8）,二、高分子性质,粘度 DNARNA 超离心沉降 凝胶过滤 分子大小单位：分子量（道尔顿，D）、碱基对数目（bp）、离心沉降常数（S）,沉淀行为加盐（中和电荷）；乙醇,紫外吸收,1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,OD260的应用,三、紫外吸收,最大吸收波长：260nm 核酸定量分析 核酸定性分析,四、变性、复性、分子杂交,1、DNA变性（DNA denaturation）：DNA变性是指在理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。,DNA的变性(denaturation),方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,DNA变性,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,当DNA的稀盐溶液加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。,融解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（Tm）或解链温度、变性温度。,实验室常用的方法热变性,影响Tm值的因素,(1)溶液的性质,(2)DNA的性质和组成,大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线,GC含量越高，Tm越大,（1）变性后理化性质改变 DNA溶液的粘度降低 浮力密度增加 旋光偏振光改变 紫外吸收增加（高色效应） 高色效应（hyperochromic effect）：DNA变性后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。,（2）变性后的DNA一级结构没有改变。,（3）融解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（Tm）,GC含量越高，Tm越大 DNA越长，Tm越大 溶液离子强度增高，Tm值增加 DNA越纯，相变范围越小,2、DNA复性,DNA复性(renaturation)的定义:在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,减色效应（hypochromic effect ）:DNA复性时，其溶液OD260降低。,DNA复性,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybridization),核酸的杂交,DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交的应用: 研究基因的位置 确定两种核酸序列的相似性 检测样品中的特异序列 基因芯片技术的基础,核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。,3、核酸分子杂交(hybridization),由不同来源的核酸单链形成杂化双链的过程,分子杂交技术的应用：基因克隆筛选、酶切图谱制作、特定基因序列的定量和定性、突变分析、疾病诊断等,第五节 核酸酶(nucleases),核酸酶是指所有可以水解核酸的酶,一、种类,1、根据底物分类 DNase、RNase； 单链核酸酶、双链核酸酶、杂合双链核酸酶,2、根据催化部位分类：外切核