α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法.doc

2.2实验方法2.2.1-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法2.2.1.1 反应溶液的制备 （1）配制底物PNPG溶液：精确称取 0.3766gPNPG，加适量0.1mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶准确定容到50mL，配制成25mmol/L的母液。将母液分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7个不同梯度的标准品溶液，备用。 （2）配制-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为14u/mg）用0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，备用。 （3）配制DNJ标准溶液（抑制剂）：精确称取 0.0010g DNJ 标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000g/mL DNJ标准母液。将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60g/mL六个不同梯度的标准品溶液，备用。 （6）0.2mol/L的 Na2CO3：称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4下保存，备用。2.2.1.2 PNP标准曲线的绘制 精确称取0.0278g对硝基酚（PNP），加0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/L母液。用蒸馏水将其母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、40、80和100mol/L的标准溶液。取100l上述标准液，各加入150L 0.2mol/L的Na2CO3，混匀 1 min ，再于405 nm处测定其吸光度，得标准曲线方程：y=128.13x+0.3579 (R2 =0.9998)，其中y 为浓度，x为吸光值。 2.2.1.3 -葡萄糖苷酶抑制活性的测定测定方法参照Masao Hattori等试验条件，并做调整。实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，各反应物按表中剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行。按表依次加入PBS缓冲液、抑制剂溶液和底物，混合均匀，于37水浴保温10min，结束后，取出，加入37水浴的酶溶液，充分混匀，于37水浴反应20min，结束后加入150L 0.2mol/L的Na2CO3溶液中止反应。由于PNPG在-葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和PNP，PNP在405nm处有最大吸收，其测定其吸光度，根据公式便可计算出各样品-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50值。 公式 表 4 各反应物添加计量和顺序 （单位：L）Table 4 The respective reactants add measurement and sequence ( Unit: L )试剂空白组对照组样品空白组样品组PBS溶液80706050抑制剂002020PNPG底物20202020充分混匀，37下孵化10min酶溶液010010充分混匀，37下反应20min碳酸钠1501501501502.2.2单因素试验设计 以底物浓度、酶浓度、酶促反应时间和添加顺序为考察因素，以DNJ的-葡萄糖苷酶抑制率为衡量指标，进行单因素试验。固定反应顺序为抑制剂+酶再加底物、底物浓度为2.0mmol/L，酶浓度0.3u/mL，缓冲液pH为6.80，反应时间为20min。2.2.2.1反应物添加顺序 分别考察如下三种不同的反应顺序对抑制活性的影响。a、 抑制剂+底物37温育10min+酶，反应20min碳酸钠终止反应测定b、 抑制剂+酶37温育10min+底物，反应20min碳酸钠终止反应测定c、 底物+酶37温育10min+抑制剂，反应20min碳酸钠终止反应测定2.2.2.2 底物浓度 选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其-葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察0.5、1.0、2.0、4.0、5.0mmol/L这5个不同梯度的底物对抑制活性的影响。2.2.2.3酶浓度 选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其-葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察0.1、0.3、0.5、0.7、0.9u/mL5个不同浓度的酶对抑制活性的影响。2.2.2.4缓冲液pH 选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其-葡萄糖苷酶抑制率为指标，分别考察不同pH6.6、6.8、7.0、7.2和7.4的缓冲液对抑制活性的影响。2.2.2.5 反应时间 选DNJ和拜唐苹为抑制剂，以其-葡萄糖苷酶抑制率为指标，考察10、20、30、40和50min不同反应时间对抑制活性的影响。参考文献1Ma C M, Hattori M, Daneshtalab M, et al. Chlorogenic acid derivatives with alkyl chains of differe