环境工程微生物学-微生物污染及其检测技术.ppt

第8章 微生物污染及其检测技术,微生物与环境污染,水体中的病原微生物,表10-1 通过粪便进入水体的病原体,水体中的主要病原微生物类群,沙门氏菌属(Salmonella） 志贺氏菌属(Shigella） 霍乱弧菌(Vibrio cholerae) 肠道病毒属(Enterovirus) 甲型肝炎病毒(hepatitis A virus）,Salmonella typhimurium (red) invading cultured human cells,LT2A-SL1344 genome,Shigella sonne的部分特性,Shigella typhimurium,微生物代谢物与环境污染,氨 硝酸与亚硝酸 氮氧化物 硫化氢 酸性矿水 甲基汞 农药代谢的毒性产物 细菌毒素 肉毒毒素(botulin) 葡萄球菌肠毒素 放线菌毒素 放线菌素 链脲菌素 洋橄榄霉素,真菌毒素 以黄曲霉毒素为例 剧毒, 黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Asp. parasiticus)产生 紫外线照射下可发出荧光 B族和G族，蓝色荧光和绿色荧光 已确定结构的黄曲霉毒素有17种，其中以黄曲霉毒素1毒性最大，致癌力最强。 藻类毒素 甲藻 蓝细菌毒素 :微囊藻快速致死因子(Microcystis FDF),第一章 环境监测中的微生物学方法,当环境受到污染后，环境的物理性质、 化学性质和生物学特性发生变化, 如： 重金属离子、NO3- 浓度增加； 水体污染变质，水生生物种类减少，甚至灭绝。,如何监测？,化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但为瞬时值； 生物学方法：利用生物种类、数量的变化，生物学特性的改变来监测污染物对环境的影响。 生物学方法的特点：可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。,一、空气微生物来源 空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。 土壤中飞扬起来的灰尘； 水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传播。,第一节 空气的卫生学检验,微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空气中，形成 “气溶胶”，借风力传播。 空气中的微生物中，真菌的孢子数量最多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病毒都会存在于空气中 。,Infection Transfer -Airborne Droplet Nuclei,二、空气微生物的卫生标准 目前，还无统一的关于空气的卫生学指标，一般以室内1m3 空气中细菌总数为501,000个以上作为空气污染的指标。,病原菌在空气中易死亡，但结核菌、白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓灰质炎病毒等，也可以在空气中存活一段时间。 尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医院、城市街道的空气中，微生物数量较多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和高纬度地带的空气中，微生物较少。,表2-1 不同场所上空微生物的数量（个/m3 ）,表2-2 以细菌总数评价空气的卫生标准（个/m3 ）,三、空气的微生物监测,采用营养琼脂平板计数法。 培养皿直径为d90mm和d100mm。 评价空气的清洁程度，需要测定空气中的微生物数量和空气污染微生物。 细菌指标：细菌总数和绿色链球菌 必要时测定病原微生物。,(一)空气微生物测定,1固体法 平皿落菌法(沉降平板法)、 撞击法(缝隙采样器、筛板采样器、针孔采样器) 过滤法。 (1)平皿落菌法 培养基融化倒入d90mm无菌平皿制成平板, 置于待测点(通常5个)， 打开皿盖暴露于空气510min， 盖好皿盖，30培养48h； 计菌落数。,通过奥梅梁斯基公式换算出浮游细菌数。 奥氏假设：5 min内落在面积100 mm2营养琼脂平板上的细菌数和10L空气中所含的细菌数相同。 奥氏公式： 式中：C空气细菌数； A捕集面积，cm2 ； t 暴露时间，min； N菌落数，个。,简化后： 奥式公式计算的浮游细菌数比实测数少。 没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流，人员密度和活动情况。,(2)撞击法： 以缝隙采样器为例， 用真空泵将含菌空气以一定流速穿过狭缝（宽度有0.15 mm、0.33 mm和1 mm三种)抽吸到营养琼脂培养基平板上。 狭缝长度为平皿半径，平板与缝间距2mm， 平板转速:1 r/min、5-60r/min、60r/min。,根据空气中微生物密度调节平板转动的速度 含菌高，转动快；含菌低，转动慢。 由取样时间和空气流量计算单位空气含菌量。 采样器的规格各国不一，操作有差异。,培养前,培养后,撞击法检测空气中微生物数量,2 、液体法,测定空气中悬浮微生物，主要细菌 将一定体积的含菌空气通入无菌蒸馏水，使微生物均匀分布在水中， 取一定量菌液于无菌培养皿中，倒入15-18ml融化的培养基，混匀、冷凝成平板， 37培养48h，计菌落数。 以菌液体积和通入空气量计算出单位体积空气中的细菌数量。,例如： 10m3含菌空气通入100mL的无菌水，微生物全部截留在水中。 取0.1 mL菌液涂布于平板上， 长出100个菌落，则10mL水中含菌10,000个，10m3空气含有10,000个。 1m3空气含有1,000个 。,(二)空气微生物的检测点数,空气微生物的测点数越多越准确，为照顾到工作方便，又相对准确，以2030个测点数为宜，最少测点数为56，见表。,表 1 日本有关标准测点数的规定,摘自许钟麟空气洁净技术原理P522同济大学出版社，1998,表2 按美国联邦标准209E方法计算的必要测点数,表 3 浮游菌最小采样量,表4 落菌法测细菌所需要的最少培养皿数(沉降0.5h),第二节 水质的细菌学检验,一、细菌总数 将定量水样（原水样或稀释水样1mL）接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板 37C培养24hr后观察结果，计菌落数， 计算原水样每毫升的细菌总数。 具有相对的卫生学意义： 菌数越高，水体受有机物污染或粪便污染越重，病原菌污染的可能性亦大（为什么？）。,二、粪便污染指示菌,人畜粪便中常常带有大量的微生物，水质的卫生学检验，对于保护人群健康，具有重要意义 有些属于正常的、对人体无害的肠道微生物， 有些则是病原微生物，进入水体后，可造成水体的污染，从而引发各种肠道疾病。 致病菌数量少，直接检测复杂，选用间接指标即粪便污染指示菌为代表。 以肠道正常细菌在水中的存在及数量作为粪便污染的指示。,健康成人粪便内的微生物数量,（一）指示菌的理想条件,大量存在于人的粪便，数量比病原菌多； 受粪便污染的水中易检测出，未受污染的水中无检测； 在水体中不会自行繁殖； 存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵抗略强于致病菌； 检出及鉴定方法比较简易迅速； 适用于各种水体。,（二）适宜的指示菌,总大肠菌群， 粪大肠菌群、 大肠杆菌埃希氏菌（大肠杆菌） 克雷伯氏菌属。,三、大肠杆菌,（一）特征 大肠杆菌定义： 一群需氧或兼性厌氧性的G-无芽孢杆菌，37C培养24hr，能发酵乳糖产酸产气。包括了粪便内全部兼性需氧性G-杆菌，以大肠杆菌埃希氏菌属为主，以及柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。 成人粪便排出菌数可达(5100)106 cfu/d。,（二）大肠菌群的测定 常用多管发酵法或滤膜法。 发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法 初发酵（推测试验） 将不同稀释度的水样，分别接种于含乳糖等糖类的培养液(3倍或1倍乳糖液), 37C培养24hr，观察产酸产气情况， 初步判断是否有大肠菌群存在。,2）平皿分离（证实试验）,水中其它细菌有可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。 初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基或远藤氏培养基上，37C培养24hr， 根据菌落特征，挑取大肠菌群疑似菌落制片， 革兰氏染色证实是否为大肠菌群。,3） 复发酵试验（完成试验）,将大肠菌群疑似菌落再次接入1倍乳糖液，37C培养24hr，产酸产气者即确证为大肠菌群。,结果计算 产酸、产气记为阳性反应， 不产酸、不产气记为阴性反应。 根据阳性管数量，查表计算水体大肠菌群数量。,2 滤膜法,发酵法检测需要时间较长，为缩短时间，可以采用滤膜法，其步骤为： 1）水样过滤：选用微孔滤膜，灭菌后抽滤一定量的待测水样，将水中的细菌截留在无菌滤膜上； 2）培养：将滤膜有菌面朝上贴于伊红美兰培养基或远藤氏培养基，经37C培养16hr18hr；,3）结果观察： 培养16hr18hr后，挑选深红色或紫红色、不带或带有金属光泽的菌落，或者淡红色、中心色较深的菌落进行革兰氏染色观察，确定大肠菌群细菌。 G- ：接入乳糖培养液中，复发酵； G+：阴性结果。 经染色证实为G-无芽孢杆菌者，再接入乳糖蛋白胨半固体培养基中，37C培养68hr，产气者