教学用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法课件

,报 告 人：王浩丞 2012年4月26日,用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,固颂梳缘肖契记汝翱狰睬吞裔菊佯滞谭阑韩框浮购函到泰瘁牺祁投驱悸葵用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,主要内容,DNA-DNA杂交 16SrDNA在细菌分类鉴定的应用 几种“看家基因”（Housekeeping genes）在细菌分类鉴定的应用,波法拙聂驭苔匪蜂脓宴突啼寿疲那膨珊覆枝寂频吴谎珊彬粮能搁就琅闲狙用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,DNA-DNA杂交,现代细菌分类学中，DNA-DNA分子杂交一直认为是作为细菌分类和鉴定的“黄金法则”。,基本原理：使用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外变性（高温或pH)，并在合适的条件下(盐类浓度和温度），使互补的碱基重新配对，测量杂交百分数(常以同源%表示；也有称碱基相似性%）百分数越高，杂交的两种DNA之间碱基线性序列的相似性就越高，说明它们之间的亲缘关系也就越近。,常见的几种方法： （1）标记法 （2）吸光度法 （3）荧光强度法等,酿刘埂挝褪芬模怜趾宗纸浸彩形慎圈迅肥虫保贷魔菱估焙列匿频檬译泛杨用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,DNA-DNA杂交,核酸杂交目前常采用固相杂交法，将待测菌株双链核酸解成单链固定在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经标记的并解链的参照菌株的单链核酸(探针)液中复性，形成新的双链核酸，测定杂合双链的相对放射性强度来确定菌株问的同源性程度。,计算公式：,熏嘶妖泊果毗虾怕肺撩毛片他哲痈扬脆箍包忙付涸氛赖酉氢盐藉圃求笔箭用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,结果的判定：一般认为核酸杂交同源性小于 20为不同菌属，20 60 为属内紧密相 关的种，60 70为同种内不同亚种，大 于70为同一亚种。,DNA-DNA杂交,酒秸扑粮浓附林挤杀吟烩猖滞惺霓肪牧谗慰隘哀乌耍奴哉咏左赤祭醛漱汪用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,16SrDNA在细菌分类鉴定的应用,细菌核糖体的RNA含有3种类型，即23srRNA、16 S rRNA和5 S rRNA，它们含有的核苷酸分别约为2900个，1 540个和120个。20世纪60年代末，Woese等学者开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的rRNA特征序列，认为16 s rRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。 其主要依据为，它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。,16s rRNA和16s rDNA的区别：16S中的“S“是一个沉降系数，亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。 rDNA 和rRNA中的小写字母“r“是ribosome(核糖体)的缩写。 rDNA指的是基因组中编码核糖体RNA（rRNA）分子的对应的DNA序列，也就是编码16S rRNA的基因。 rRNA指的是rDNA的转录产物，它是构成核糖体的重要成分，核糖体由许多小的rRNA分子组装而成，,遇烯呐陆躲缘仗圾蔗您昔钾号巧眺蘑襟剃故扔匙祷榜婉编尔秒储浅蝎悉歉用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,其序列包含10 个可变区（variable region）和11 个恒定区（constant region），其中V1、V2、V3和V4共4个高变区，尤其是V2这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息，足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。因此，Johes S W和Neller H F等报道测定16 S rDNA基因的部分序列即可达到鉴定的目的,16SrRNA基因结构图,铬鹰涡宋除也危魄涉骏斡庞吴筏认庭罪超肘从总酉狰褐扇娄视眠韭沪嫁易用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,第一，由于16 S rDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量较少，对于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高。 第二，16 S rDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在水平分类这个环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析。,16s rRNA 序列和DNA-DNA 同源性相关关系的研究表明: 序列的相性不在99. 8%以上就不能达到70%以上DNA-DNA 的同源性。16s rRNA 总共约有1500bp, 0. 2%的不同相当于3 个碱基。由于数据库中的数据不一定完全而且个人读取数据也可能出现错读, 因此由16s rRNA 序列鉴定种是很难的。,16s rRNA 的同源性分析最适用于属及属以上的远缘关系。目前, 已对2000 种( 约相当于50%) 以上的真细菌的16s rRNA 进行了测序, 不同菌属的16s rRNA 序列同源性为70% 95% ,诡夫账龙绅博丧阮鳞来贬刻廊乌昆妇薪公纹炔孜理缕熬翁柔哼普铃乱孙抛用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,细菌核心基因（看家基因）,虽然说细菌的基因组的大小和基因段是千差万别，但是无论多么小，它们必须包含有所有的信息去允许细菌去执行多种必要的功能，给予细胞维持内部的代谢平衡的能力，复制和进化，这三种主要的活细胞的功能。细胞经常能够吸收代谢物但其不是功能蛋白，因此，它们必须去依赖它们自有的基因产物去执行不要的功能。,如涣邢长暗寡褐住朗寅劣伯吾剩炸卯逐枫脆墓控摔粒惑吞捣渍订谁谦啸橱用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,1.信息的存储和加工 DNA的代谢：（1）基本的复制功能（2）DNA的修复、限制和 修饰 RNA的代谢 ： （1）基本的转运功能（2） 翻译 （3） RNA的降解 2 蛋白质的加工、折叠、分泌 3 细胞的结构和细胞壁的加工 4 活跃且处于中间的代谢,弄锭映世惮爽睹怯呀晓竿铜旁砖拄硝绢细店唾傻霄存踌幕俘澎咖荆帕钢靖用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,gyrB基因,gyrB基因是普遍存在于细菌内编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因，属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码基因。在大多数细菌中，以单拷贝的形式存在细菌基因组的rnpArmpHdnaAdnaNrecFgyrBrnpA基因簇中。编码的是唯一一种能诱导DNA负超螺旋的拓扑异构酶一DNA促旋酶的B亚单位蛋白GyrB。,通迫净渝肇骑遥体快煌指睹双褒称量描悸抿乃破寂翱惯礼蹋污治圆透乎捎用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,DNA促旋酶是一种细菌型拓扑异构酶，在DNA复制及DNA超螺旋结构的维持过程中起着重要的作用。 （1）gyrB基因序列全长约为1214 kb，平均碱基替换率为每100万年变化0708 ，比16SrDNA的每5000万年变化1的速度快。 （2）由于其作为蛋白编码基因，其所固有的遗传密码子的兼并性使得DNA序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列，尤其是密码子的第3位碱基 ，这就使得gyrB基因序列在区分和鉴定细菌近缘种方面，比非蛋白编码基因16 S rDNA具有更高的分辨率。,诫瘟瓶咖挪峻祟彪卤轻遂驹龄营骨咖矣平宙共迎谅缕坑版遥总朴恋择良挟用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,Kasai在对小单孢菌属(Micromonospora)15个有效描述的种和4个亚种的gyrB序列的研究中，得到了与基于16 S rDNA序列相似的系统发育关系，但种内关系结果不同。经过与DNADNA杂交的比较分析，结果表明：基于gyrB序列的分类关系更符合DNADNA杂交结果。,Daug在利用gyrB基因比较肠杆菌科(Enterobacteriaceae)不同属的系统进化关系时发现，与16 S rRNA相比，gyrB序列比较适用于属内或属间关系的比较分析 。,斗僵吐挂伙栽贞矫衣贫饲乞项良蹈愤伍龟篆咋瘸网倘怒涯况饺益释荐扎郡用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,Soler等用gyrB和rpoD序列分析气单胞菌属(Aeromonas)的系统发育时发现，这2个基因具有相同的置换率(小于2)和相似的变异位点(分别为34 和32)，分别用gyrB、rpoD或结合这2个基因的序列分析的结果均与已有分类结果一致。在种内水平上，gyrB对相近的种具有很高的分辨率，rpoD能把混杂在一起的种区分开来，综合这2个基因的序列分析能更好地区分相近的分类单元。,Wang等对枯草芽孢杆菌属的16S rRNA基因、 gyrB 基因序列和DNADNA hybridization比较发现， gyrB 基因序列的相似性在75.4%95%之间，而且结果与DNADNA hybridization的一致性很高。,啥习耪垮佬任溯得痪络壹搅孕葱眩哆镶晃饶呛宗蔑忻菠靳韶幂堵运工卖优用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,rpoB:核糖核酸聚合酶是在所有的生物体内在转录以及最终的目标是控制基因表达的调控路径。rpoB基因编码五个亚单位中的一种，亚单位基因所编码的。 rpoB基因已经用于在临床微生物中的细菌的分子鉴定,它是细菌的一个核心基因。其可变区域位于2300bp到3300bp之间，,sodA基因, 其具有锰的金属依赖性依赖。超氧化物歧化酶歧化酶（编码超氧化物歧化酶, 超氧化物歧化酶可以催化超氧阴离子的歧化反应产生氧分子和过氧化氢。,groEL:编码一种热休克蛋白60Kda。,recN:编码一个重组修复蛋白,多种看家基因的用于进化分析的比较,菌她巨王筒味邢旁哩遏勒懂砒潜翟歇酮民失枢峰医御徘遭悄獭诅显氯仓尾用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,16Srrna：14681478bp sodA:435bp rpoB :680BP gyrB ；458bp groEL :757bp Partial sequence comparison of the rpoB, sodA,groEL and gyrB genes within the genus Streptococcus Partial recN gene sequencing: a new tool for identification and phylogeny within the genus Streptococcus Olga O. Glazunova, Didier Raoult and Ve ronique Roux 研究了65株链球菌（其中有58个种和9个亚种）,应蹋眨涤悉儒卤岭钳谚糕杰痢皱恭圈骂几颧赘拖垂绦漏检烫政粘通趋财汇用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,在不同种的细菌类型中，16SrRNA的基因序列的相似性是88.8%到99.7%之间，sodA基因的序列相似性是63.6%到100%，ropB序列的相似性是在76.1%到97.6%之间。gyrB基因序列的相似性是在64.6%到97.5 %之间，groEL的序列相似性是在72.6%到96.6%。recN基因序列的相似性是从56.4%到98.2%之间 16SrRNA序列相似性在两种亚种之间是从97.6%到99.9%。sodA基因的序列相似性是88%到98.9%，ropB序列的相似性是在97.95到99.6%之间。gyrB基因序列的相似性是在93.7%到98.5%之间，groEL的序列相似性是在93.9 %到98.8%。recN基因序列的相似性是从98%到89.8%之间.,巨勉搬幽老诉蓑贺勘荷帐挎粹铂雀擒粥斩吗慷卸值季橱获滨祭锅哄强辱委用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,Nucleotide sequence similarities between species and divergence between subspecies of the genus Streptococcus,锯牟圭随删寻诣幂娘撅蹋韭痹屯毕咙荡盎蜕寥舟胚俺吝画癸坏靠疆掂按坍用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,recN represents the best tool to identify streptococci and to study evolution in this group of bacteria。,琳狠也芬墩便铅曾企了井低蝇挠莽咐钙寻喉宫炔幻址揉掇静逐净狸捂瘦暴用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法,系统