细菌的耐药机理及检测方法.ppt

细菌的耐药机理及检测方法 西京医院检验科 徐 修 礼,随着抗生素的广泛大量的滥用、介入性治疗、免疫抑制剂应用及某些基础疾病的发生。细菌性感染已是临床重要的常见病，且耐药性和耐药水平越来越高，给疾病的治疗及临床用药造成诸多困难。病原菌对常用抗生素，如-内酰胺类、氨基糖甙类和喹诺酮类药物的耐药性尤为突出，及时了解细菌的耐药机制和抗生素的发展及应用对策，对我们预防和治疗细菌性感染、制备新的抗菌药物及控制耐药性的蔓延是非常重要的。,药物作用机制落后于细菌对抗生素耐药性传播的发展，药物作用机理主要是通过干扰细菌核酸的合成、抑制核糖体的功能、抑制胞壁的合成及叶酸盐的代谢等。细菌对抗生素的耐药机制包括遗传和生化两种方式：遗传方式包括固有耐药（天然性）和染色体突变产生的耐药或获得新的DNA分子；生化方式是指细菌获得性耐药或质粒介导的耐药，主要包括：产生B-内酰胺酶、乙酰基转移酶、腺甘酸酶、磷酸化酶、拓扑异构酶等对药物的灭活作用；依靠菌膜的特性降低药物的通透性；改变抗生素作用的靶位，缩短与药物结合的时间；产生药物代谢的旁路；大量产生青霉素结合蛋白（PBPS），降低抗生素的新生力；发展产生耐受；产生抗生素导出泵。,遗传方式,固有耐药 固有耐药具有种属特异性，来源于该细菌固有的自然特性，即本身具有耐药基因存在染色体上，非发酵的G-杆菌如绿脓秆菌、醋酸钙不动杆菌、假单胞菌属及大多数G-杆菌耐万古霉素和甲氧西林，肠球菌耐头孢菌素，厌氧菌耐氨基糖甙类药物等，这些菌的高度固有耐药性是由于菌体外膜的通透性低与继发的双重耐药机理（诱导产生头孢菌素酶和抗生素导出泵）导致的。,染色体突变或获得新的DNA分子 突变可发生于DNA分子，如结核杆菌的点突变可导致对利福平的耐药，淋球菌的点突变可导致对苯唑西林的耐药；也可发生于质粒和转座子的基因上，如质粒编码产生的超广谱B-内酰胺酶（ESBL）可能由于TEM和SHV酶基因的点突变导致的，这些点突变集中于基因的5个区域内，残基的突变能改变B-内酰胺酶与头孢菌素的结合形成，消除阻遏作用，导致抑制和水解三代头孢菌素，如果酶基因的连续突变可从本质上增强酶的活力，使新一代头孢菌素灭活；某些DNA调节区基因的突变可产生头孢菌素酶导致对第三代头孢菌素耐药。,耐药性可通过接合、转导和转化在微生物间传递，外源性相关的DNA小片段组合为内源性基因几乎都通过自然转化和重组形成，质粒接合传播的方式最普遍，但宿主范围局限，尚未发生可在G+和G-菌中都能复制的质粒，而转座子的宿主范围较广，可在G+和G-菌间转移，如染色体内的AmpC基因可通过转座子越位至质粒中，使某些细菌获得诱导产生能力极强的I型酶，称之为AmpC型ESBLS株（如肠球菌、克雷伯氏菌、某些肠杆菌科的细菌），是耐药性传播的重要原因之一。,生化方式,细菌获得性耐药的生化机理主要有以下几种。 1.酶的灭活作用 通过水解或修饰作用破坏抗生素的活性。 （1）-内酰胺酶 质粒介导或染色体突变使细菌产生-内酰胺酶，可水解破坏-内酰胺酶，使B-内酰胺类抗生素失活，这是大多数致病菌对此类抗生素产生耐药性的主要机制。目前B-内酶胺酶已有230余种，包括TEM系列酶、SHV系列酶、OXA系列酶、PSE系列酶、头孢菌素酶等，质粒介导的酶在G-菌中分布较广，以TEM-1最普遍，其次为OXA-1。,根据分子量、等电点、被抑制谱、对底物的水解谱等将B-内酰胺酶又分为4类，类酶由染色体的AmpC基因诱导产生，多种需氧G-杆菌（如大肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、阴沟杆菌等）可产生此酶；类酶临床上最为重要，分5个亚类（2a、2b-2b、2c、2d、2e），大多数G+菌产生的酶（如pc1）属于2a亚类，2b亚类（如SHV-1、TEM-1），2b亚类（如TEM-3、SHV-2），2c亚类（如PSE-1，PSE-4）,2d亚类（如OXA-1和PSE-2），2e亚类（如FEC-1）少见，由大部分G-菌产生。随着新的-内酶胺类抗生素的临床应用，由大部分G-菌产生。,随着新的-内酶胺类抗生素的临床应用，新的酶类不断产生，近年报道的ESBL可能来源于TEM和SHV酶，由于其有有序列的基因点突变导致的，该酶最早发现于肺炎克雷伯氏菌中，仅局限于少数肠杆菌和肠球菌中，可水解头孢菌素及单酰胺类抗生素，特别表现为相应的产酶菌对头孢噻肟、头孢他啶和氨曲南的耐药，并可引起对其氨基糖甙类抗生素的耐药。,新近研究发现，过量产TEM和SHV型酶的的细菌具有含锌的-内酶胺金属酶，此酶的催化效率极高，不仅存在于窄食假单胞菌中，也偶见于其它细菌，此酶对碳青霉烯类抗生素也有耐药性，且不易受酶抑制剂的影响。内酰胺酶阳性的嗜血杆菌属、淋球菌和卡他莫拉菌对青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药；-内酰胺酶阳性的葡萄球菌和肠球菌对青霉素和乙酰氨基青霉素、羧基青霉素和脲基青霉素耐药。注：只对嗜血杆菌属，淋球菌，卡那莫拉菌、葡萄球菌和肠球菌测定-内酶胺酶，不要对肠杆菌科，假单胞菌属及其他需氧G-杆菌进行此试验。,（2） ESBLs 1983年由khothe在德国发现，1985年正式报道，该酶为丝氨酸蛋白酶的衍生物，它是由于-内酰胺酶上14位点氨基酸发生了突变，并可以通过质粒传播，由质粒介导的耐药比由染色体介导的耐药多，它可在不同菌株、菌种或菌属间转移扩散。突变产生的ESBLs抗药性广，且在ESBLS的质粒上常携带对其它抗生素如氨基糖苷类及氟喹诺酮类的耐药基因，呈多重耐药性。,ESBLS的分类：根据酶的来源可分为TEM系列：为TEM1、TEM2的突变酶，此系列酶等电点一般介于5.16.5，绝大多数酶分子量（MW）为29KD，从TEM3起已发现有TEM-70，而且还在增加；SHV系列：此系列酶的等电点较高，介于7.08.2，分子量主要为29KD，从SHV-2起，现已发现SHV-12；非TEM和SHV系列。如确认为ESBLs菌株，不管体外药敏试验的结果如何，对所有青霉素类、头孢菌素类和氨曲南均应报告耐药。此酶对酶的抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦抑制。,（3）AmpC酶：1976年开始研究，但直到1990年由PaPani Colaoll等才首先证实了此酶的存在。由染色体介导的AmpC酶已发现50多种，基因带有调控序列，呈诱导型表达，酶的活性不被克拉维酸、EDTA抑制，可被邻氯西林、头孢西丁、BRL-42715、RO47、RO48等抑制剂抑制。携带染色体型AmPC基因的细菌主要有肠杆菌科、不动杆菌属、绿脓杆菌等，根据产酶水平的高低和表达方式可分为：野生型，通常所定义的AmpC酶属于此型；基础型、低水平非诱导型表达，临床定义不大，如E.Coli的染色体型AmpC酶；高诱导型，诱导后的产酶水平远高于野生型；去阻遏突变型，持续或半持续高水平产酶。,由质粒介导的酶可分56组：弗氏枸橼酸杆菌组有LAT型和某些CMY型，肠杆菌属有MIR-1型和ACT-1型，摩根摩根组有DHA-1型和DHA-2型，气单胞菌组有MOX型、FOX型和其他CMY型等。质粒上的AmpC酶基因大小从7180kb。酶分子大小约3842KD，具有378386个氨基酸。高产AmpC酶细菌通常对第四代头孢菌（如头孢吡肟）敏感，对碳青霉烯类敏感，对头霉素类（如头孢西汀）耐药，不被酶抑制剂所抑制。如果分离的菌株对三代头孢菌素耐药，且不能被克拉维酸抑制、对泰能敏感、对头孢西汀耐药可初步推断为高产AmpC酶的细菌。,（4）氨基糖甙类灭活酶 双功能的氨基糖甙类灭活酶（6-N-氨基糖甙类乙酰转移酶，2-O-氨基糖甙类磷酶转移酶）是葡萄球菌和肠球菌高水平耐氨基糖甙类药物的重要机制。此酶在分子不同的区域内存在两种不同的氨基糖甙改造因子，是由Th4100转座子内6-aac-a-2基因编码合成，该基因可插入R质粒及氨基糖甙类抗生素染色体基因中，导致在G+菌中氨基糖甙类抗性的快速传播。这种双功能酶与其它抗生素抗性因子无任何基因关联，真核蛋白激酶抑制剂能抑制磷酸转移酶的活性，提示这种双功能酶可能是蛋白质家族中的两种普通结构，为临床提供开发这种功能酶抑制剂的可能。,（5）乙酰基转移酶 某些细菌（如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌、肺炎球菌及流感嗜血杆菌等）对氯霉素耐药性主要是由于质粒编码产生的乙酰基转移酶所致，该酶使氯霉素转化为无活性的代谢产物，失去抗菌活性。,（6） 拓扑异构酶 该酶又称DNA旋转酶，由gyrA和gyrB编码，基因的突变引起靶酶DNA旋转酶的改变，使喹诺酮类药物失去抑制此酶的活性，而使细菌获得耐药。基因的突变常位于60-106残基区域内，在大肠杆菌中约为第83个丝氨酸，金黄色葡萄球菌中为第84个丝氨酸。,2.菌膜通透性的改变 由于药物的作用，细菌改变了外膜蛋白，使菌体外膜通透性降低，阻碍抗生素进入细菌内膜靶位。外膜通透性降低主要由于膜孔蛋白缺陷、多向性突变、特异性通道的改变及膜脂质双层的改变。常见于假单胞菌、醋酸钙不动杆菌、肠球菌等对B-内酰胺类、氨基糖甙类、氯霉素、喹诺酮类抗生素的耐药。,3.改变抗生素的作用靶位 细菌在抗生素的作用下通过产生诱导酶对菌体成分进行化学修饰，使其与抗生素结合的有效部位变异，使药物不敏感，而细菌的生理功能正常。常见的药物有甲氧苄胺嘧啶、磺胺类、氨基糖甙类、氯霉素、喹诺酮类药物。如DNA中A位点基因的突变导致回旋改变造成喹诺酮类耐药；核糖体RNA甲基化抑制红霉素结合；PBP的改变导致对B-内酰胺类抗生素的耐药，PBP的改变主要有PBP数量改变或缺失、药物与PBP的结合力降低、细菌产生诱导型PBP或缓慢结合的PBP。,这种由PBP介导的耐药性在G+菌中较G-菌更常见，最常见于耐甲氧西林的葡萄球菌，主要与PBP2a的存在有关，该蛋白是一种转肽酶，负责细胞壁的合成，且由mecA基因编码，位于DNA外区域mec内， 受质粒携带的blaRI-blaI诱导抑制子及mecRI-mecI基因所编码的蛋白质调控的，在抗生素的治疗中，mecA基因编码产生OXA系列酶，诱导表达产生大量的PBP，使药物不易与胞壁结合，导致药物的作用降低或失活。,4.产生药物代谢的旁路 抗生素可与靶位结合，但靶位的生理作用已被某种新生成份代替，如G+菌耐灰黄霉素的机制可能与其产生旁路有关。,5.产生耐受 对-内酰胺类杀菌效应的耐受发生在抗生素低浓度时，细菌的生长状态被抑制，需很高浓度才能将其杀灭，呈最低仰菌与最低杀菌浓度分离，这是由于细菌过度分泌自溶抑制因子而降低了细菌的自溶性，这种耐受性表现为细菌虽不对B-内酰胺类抗生素耐药，但仍不被杀灭，致使抗生素治疗效果不佳，噬菌体可能与非耐受性转化有关，但其转染机理不明。,6. 产生导出泵 导出泵的产生是受流出基因控制的，此基因存在于质粒上，在G-肠杆菌中该基因受抑制子调控，在G+菌中此基因受减毒机制调控，如G+菌对四环素的耐药性主要是导出泵的建立和核糖体的保护作用，至少有一种核糖体保护基因受减毒机制调控，且其耐药流出基因可以在不同的细菌间传递。与核糖体保护性相关的基因既存在于质粒上，也存在于染色体的共轭转座子上，该转座子最初发现于链球菌中，可转染给其它G+菌、G-菌及支原体，四环素耐药基因和基因的刺激转导对其它受体菌来说具有双重效应。,另外，G-杆菌导出泵的建立，易造成多重耐药，已发现旋转酶突变与导出性耐药机制共同存在，多重耐药机制在同一菌株中同时产生，容易产生对药物的高度耐药。 7.超级整合子(基因盒) 铜绿假单胞菌对碳青酶稀类的泵出机制：美平/泰能(MIC) 1占17.6%。(国外15%-35%)。 超级整合子（耐药基因盒）：10.26%。,耐药筛选,耐药筛选,细菌耐药的主要机制,抗生素靶位点改变 ,孔蛋白改变， 细胞壁/膜 通透性改变,超级整合子(基因盒),产生灭活酶,耐药细菌的扩散,敏感细菌,耐药细菌感染的后果,细菌耐药的直接后果 增加患者住院时间与住院率 增加死亡率 增加感染发病率(MRSA, VRE, ESBL) 增加医疗费用 抗生素后时代 间接后果 无法治疗的感染 对生产力损失 估计美国每年损失： $40亿美圆,关于药物的几个概念,（1）抗感染药物（anti-infective agents）”包括用以治疗各种病原体（病毒、衣原体、支原体、立克次体、细菌、螺旋体、真菌、原虫、蠕虫等）所致感染的各种药物“ （2）抗微生物药物（anti-micyobial）较抗感染药物略窄，抗蠕虫药物一般不包括在内 （3）抗生素（antibiotics）：在高稀释度下对一些特异微生物有杀灭或抑制作用的微生物产物。以后将用化学方法合成的仿制品，具有抗肿瘤、寄生虫等作用的微生物产物，以及抗生素的半合成衍生物等也统称为抗生素。但非微生物产物的全合成药物如喹诺酮类、咪唑类等不应列入抗生素。 （4）抗菌素（antibacterial）：此名称现已摒弃不用 （5）抗菌药物（antibacterial agents）：指具有杀菌或抑菌活性，主要供全身应用（含口服、肌注、静注、静滴等，部分也可用于局部）的各种抗生素、磺胺药、异烟肼、咪唑类、硝咪唑类、喹诺酮类、呋喃类等化学药物。 （6）化学治疗药（chemotherapeutic agents）：应用于临床上一切具有化学结构（含尚未阐明者）的药物统称。,对当前临床上面临严峻的细菌耐药性及其发展，耐药性从G-杆菌发展到G+球菌，由院内感染发展到院外感染。对耐药菌感染的治疗尚无可靠的药物，对预防和控制耐药菌的出现和传播尤为重要，我们应采取积极有效的措施来保护人类的健康。控制细菌耐药性的对策主要有：加强对已出现的耐药菌进行动态耐药性监测，争取及早作出病原学诊断，有针对性选择抗生素；加强和严格执行消毒隔离制度，尤其是在耐药菌严重感染的重症监护病房等单位，防止交叉感染；合理应用抗生素，严格掌握用药原则。,从目前来看，通过研究新的抗生素和消除细菌耐药性基因来控制细菌耐药性还未取得令人满意的进展，因此对抗生素的使用进行宏观管理与控制是减少耐药性产生的重要措施，如尽量减少青霉素的预防性应用，控制第三代头孢菌素及其它新的B-内酰胺类、氟喹诺酮类药物的大量应用，根据临床细菌药敏感结果、患者自身感染状况合理选择抗生素联合应用；4研制新的抗生素，对产酶菌开发新型稳定的制剂，如对青霉素和头孢菌素用取代基替代6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸的氨基酸组，或用a-甲氧基替代青霉素中的6碳和头孢菌素中7碳上的氢，对羧苄青霉素可结合一个6-氢氧基组分，使抗生素增强B-内酰胺酶的水解能力。,开发G+球菌感染治疗的有效药物，如链阳菌素为原始霉素的衍生物，可与细菌核糖体50s亚基中的不同位点结合，抑制蛋白质的合成，达到杀菌的目的，该药主要用于耐甲氧西林的葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌及流感杆菌、奈瑟氏菌属、卡他莫拉氏菌等感染的治疗；甘氨酰环素为多四环素与米诺环素的半合成衍生物，对MRSA、MSSA、肠球菌、链球菌属、肺炎球菌有强大的作用，对G-杆菌和厌氧菌亦有良好作用，可能成为治疗多重药菌感染的有效药物；2-吡啶酮类药物其结构与氟喹诺酮类相似，其抗菌谱广，对各种G-杆菌、G+球菌及厌养菌均有良好的抗菌活性，可能适用于各种呼吸道、皮肤、软组织及尿路感染，以及作为严重感染的经验用药；,恶唑烷酮类为全新的化学结构，以U-100592、U-100766为代表，与已知抗生素无交叉耐药，对G+球菌有强大的杀菌作用，对厌养菌、结核杆菌也有良好作用，但对G-杆菌无作用，机理为作用于细菌蛋白合成的起始阶段，抑制30s核糖体起始复合物的形成，该药有望成为临床治疗耐药性G+菌感染最有效药物。研究消除耐药质粒。细菌的耐药性大多由其质粒上的耐药基因控制的，如能消除细菌中的耐药质粒，则可降低细菌的耐药性，到现在为止，国际上还没有一个较好的可供体内使用的清除R质粒的方法，这方面研究的难度很大，但仍需继续努力。进一步深入研究细菌的耐药机制，不断更新防治耐药菌的措施。,细菌的耐药机理越来越复杂，不断有新的耐药机制出现，这是细菌与人类生命相互抗争的较量，尚需人们付出艰苦卓绝的研究工作，逐步控制和减少细菌的耐药性，以至最终消灭耐药菌，使人类在和平美好的环境中健康快乐地发展。,附注： -内酰胺酶的检测: （1）头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸片灭菌水湿润涂测试菌于纸片上，10min观察纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观察）。 （2）酸度法：青霉素-内酰胺酶水解青霉酸、pH6.8以下酚红指示剂由红色（构橼酸钠缓冲液pH8.5）变为黄色。 （3）碘测定法：-内酰胺酶破坏-内酰胺环，碘与破坏后的-内酰胺结合，使兰色的淀粉碘复合物转变成无色。 （4）仪器测定法：Vitek- AMS、Microscan的药物测试卡中均带有测酯功能。,ESBLS检测： （1）纸片扩散初筛：头孢他啶（30g/片）抑菌圈22mm 头孢噻肟（30g/片）抑菌圈27mm 头孢曲松（30g/片）抑菌圈25mm 氨曲南（30g/片）抑菌圈27mm （2）肉汤稀释法：上述药物MIC2g/ml可疑为ESBLS。（表型确证试验：对2个任何一个药物MIC，在加克位维酸比不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度判为ESBLS）。,（3）双纸片协同确认试验： 头孢他啶（30g/片）与头孢他啶（30g）/克位维酸（10g） 头孢噻肟（30g/片）与头孢噻肟（30g）/克拉维酸（10g）两纸片抑菌圈相比5mm即为ESBLS。 （4）E-test法（浓度梯度法）：由瑞典AB Biodisk公司研究生产，广洲贝肯公司经销。试条中的三代头孢菌素或氨曲南的MIC2g/ml即可疑为ESBLS。,（5）仪器测定法：Vitek,microscan和BD-PHOEMXTM微生物分析仪均可测试ESBLS。 （6）利用分子生物学技术（PCR、DNA探针等）及分析酶底物谱及抑制物谱、生物化学技术等检测技术可对ESBLS做出确诊。,Ampc酶检测： （1）初筛： 头孢西汀（30g/片）与头孢西汀（30g）/邻氯西林（200g）。后者比前者的抑菌圈5mm即疑为Ampc。 5种纸片筛选：马斯平、泰能、头孢西汀、头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸。如头孢西汀18mm，对马斯平、泰能敏感即疑为产Ampc，如头孢他啶与其酶抑制剂的抑菌圈5mm可能产ESBLS。 （2）确认试验（头孢西汀三维水相试验法）,一金属-内酰胺酶的表型检测方法,(一)头孢他啶+2-巯基丙酸法(CAZ+NCA) 1.将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。 2.在M-H平板上分别贴两片头孢他啶(30ug/片)纸片，纸片中心相距2.5cm,将其中一片头孢他啶纸片上加3ul 2-巯基丙酸，35孵育18-24h。 3.结果观察：若加有2-巯基乙酸的头孢他啶纸片抑菌圈大于单个头孢他啶的抑菌圈（4mm），则为阳性，即产金属-内酰胺酶。,一金属-内酰胺酶的表型检测方法,(二)亚胺培南+EDTA法(IMP+EDTA) 1.将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。 2.在M-H平板上贴一片亚胺培南(10ug/片) 纸片，在距亚胺培南纸片中心1.5cm处贴无菌空白纸片一片，将0.5M