肝癌抗原肽EPVTKAEML与人HSP70融合基因的构建及原核表达.doc

肝癌抗原肽（EPVTKAEML）与人HSP70融合基因的构建及原核表达 作者：曲萍, 马加海, 黄勇, 刘利兵, 铁茹, 刘芳娥, 黄小军【摘要】 目的: 构建及原核表达肝癌抗原肽（EPVTKAEML）与人热休克蛋白70（HSP70）的融合基因。方法: 采用加端PCR方法, 将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3端; 将融合基因克隆入原核表达载体pET28a(+)中, 构建重组质粒pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70。经限制性内切酶BamH I、 Xho I双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21（DE3）, 经IPTG诱导表达融合蛋白, SDSPAGE检测表达结果。结果: 应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段, 序列测定结果证实, EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3端。经BamH I、 Xho I酶切鉴定证实, 融合基因成功地克隆到原核表达载体pET28a(+)上; 转入重组质粒的E.coli BL21（DE3）经IPTG诱导后, SDSPAGE分析发现在相对分子质量（Mr）约72000处有表达量明显增多的蛋白条带。结论: 成功地构建并表达了肝癌抗原肽（EPVTKAEML）与人HSP70的融合基因。 【关键词】 肝肿瘤/免疫学 抗原 肿瘤/遗传学 表位 热休克蛋白类70/遗传学 基因表达Abstract AIM: To construct and express a fusion gene of human heptoma peptide (EPVTKAEML) with human heat shock protein 70 (HSP70). METHODS: A cDNA fragment encoding EPVTKAEML was added to 3 terminus of human HSP70 gene by PCR amplification. The PCR products of fusion gene were cloned into pET28a(+)vector. The recombinant plasmid pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70 was identified by enzyme digestion analysis and sequencing, and then it was transformed into E.coli BL21(DE3) through IPTG induction to express the target protein bearing His tag. RESULTS: A fragment of about 2.0 kb was amplified by PCR. Sequence analysis revealed that the sequence of EPVTKAEML was connected successfully to 3 terminus of human HSP70. Enzyme digestion analysis showed the fusion gene was cloned into pET28a(+). SDSPAGE showed that a Mr 72 000 fusion protein was expressed. CONCLUSION: The fusion gene of EPVTKAEMLHSP70 has been successfully constructed and expressed in E.coli BL21(DE3).Keywordshepatoma/immunology; antigen; neoplasm/genetics; epitope; heatshock protein 70/genetics; gene expression原发性肝癌是严重危害我国人民身体健康的恶性疾病之一。近几十年来, 尽管诊疗手段有了很大的进步, 但肝癌的预后并没有得到显著改善。生物治疗是肝癌治疗的重要手段之一, 尤其可能在复发转移的控制中发挥重要作用。我们应用弱酸洗脱质谱法首次从肝癌细胞系中成功分离了MAGE1编码的由HLAB7提呈的肝癌抗原肽EPVTKAEML, 将其负载DC细胞, 在体外及裸鼠体内均可诱导抗肝癌特异性免疫反应1, 2。为加强EPVTKAEML的免疫原性, 选择具有诱导抗肿瘤免疫作用的HSP70为载体, 制备了EPVTKAEML与HSP70的融合蛋白, 为进一步观察融合蛋白能否诱导产生肝癌抗原肽特异性CTL, 寻求更有效的抗肝癌抗原肽疫苗奠定基础。1 材料和方法1.1 材料 菌种E.coli BL21(DE3)由本室保存。原核表达载体pET28a(+)、 含HSP70基因全长片段的质粒 pCDNA3.1(+)/HSP70 (本校病理学教研室惠赠), B型质粒小样快速提取试剂盒和B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒(北京博大泰克公司), Pyrobest DNA聚合酶、 T4连接酶、 限制性内切酶(TaKaRa公司)。1.2 方法1.2.1 用加端PCR方法构建EPVTKAEML与HSP70的融合基因 根据HSP70基因的核苷酸序列, 结合引物设计的原则, 设计引物, 在下游引物的5端加入EPVTKAEML的核苷酸序列(共27个碱基), 并在引物两端分别加入BamH I及Xho I酶切位点, 引物在上海生工生物工程技术有限公司合成。上游引物: 5CGG GAT CCA TGG CCA AAG CCG CGG CG3, 下游引物: 5CGA CTC GAG TTA CAG CAT TTC AGC TTT GGT AAC CGG TTC ATC TAC CTC CTC AAT GGT GGG3。此序列中2处下划线部分分别为BamH I和Xho I, 黑体（加粗）部分是肝癌抗原肽EPVTKAEML。反应条件为: 94预变性5 min, 94 变性1 min, 58退火50 s, 72延伸3 min, 循环1次; 94变性1 min, 68退火及延伸3 min, 循环28次, 另加72延伸7 min, PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳, 回收。1.2.2 重组质粒pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70的构建 用BamH I和EcoR I双酶切PCR扩增的融合基因EPVTKAEMLHSP70和表达载体pET28a(+), 进行琼脂糖凝胶电泳。分别回收目的片段和表达载体, 以T4 DNA连接酶于16连接16 h, 转化感受态E.coli BL21(DE3)。卡那平板筛选阳性克隆。提取阳性克隆菌质粒, 以BamH I和EcoR I酶切和DNA序列分析鉴定阳性克隆。1.2.3 融合基因EPVTKAEMLHSP70的诱导表达 将含pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70质粒的E.coli BL21(DE3)接种于5 mL含100 mg/L卡那霉素的LB培养液中, 37震荡培养至A0.5, 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L, 继续培养3 h取出, 离心收菌, 加入SDSPAGE上样缓冲液, 混匀, 煮沸5 min, 12000 r/min离心10 min, 取上清做SDSPAGE, 考马斯亮蓝R250染色。2 结果2.1 肝癌抗原肽与HSP70融合基因的构建 以pCDNA3.1(+)/HSP70质粒为模板, 在下游引物的5末端引入27个碱基的模拟表位基因, 经加端PCR使EPVTKAEML与HSP70的序列连接起来, 获得了2.0 kb的融合基因, 与预期片段的大小一致(图1)。图1 EPVTKAEMLHSP70融合基因PCR结果的琼脂糖凝胶电泳（略）Fig 1 Agarose gel electrophoresis of EPVTKAEMLHSP70 fusion gene PCR productM: DNA marker; 1: EPVTKAEMLHSP70 (2.0 kb).2.2 融合基因的序列分析 PCR构建的融合基因克隆到pET28a(+)载体上, 选取1株酶切鉴定正确的克隆, 用双脱氧终止法测定序列。序列分析的结果表明, 肝癌抗原肽基因序列已连接于HSP70的3末端, HSP70序列与基因库中的一致。在HSP70的5端有起始码, 抗原肽基因序列的3端有终止码。2.3 原核表达载体pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70的鉴定 用BamHI、 XhoI从pET28a(+)载体上消化释放出2.0kb大小的片段(图2)。图2 pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70重组质粒的酶切鉴定（略）Fig 2 Identification of recombinant pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70M: DNA marker; 1: pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70 digested by BamH I and Xho I.2.4 融合基因在大肠杆菌中的表达 重组的表达载体pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70在BL21(DE3)菌中经IPTG诱导表达, SDSPAGE(图3)显示经IPTG诱导的重组载体在Mr 72000有表达明显增多的蛋白条带, 与预期大小一致, 未经诱导的重组载体未见此现象。图3 原核表达EPVTKAEMLHSP70融合蛋白SDSPAGE电泳分析（略）Fig 3 Analysis of prokaryotic expression EPVTKAEMLHSP70 by SDSPAGEM: Protein marker; 1: The split supernatant of pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70 bacterial before IPTG induction; 2: The split supernatant of pET28a(+)/EPVTKAEMLHSP70 bacterial after IPTG induction.3 讨论 随着对抗原加工和提呈过程的了解, 人们发现T细胞识别抗原实际上只是识别一段能与MHC分子相结合的多肽3。因而如果用相应多肽作为肿瘤疫苗就能够直接引起机体T细胞的反应。目前许多能被T细胞识别的肿瘤抗原多肽已确定, 这也使得用多肽作为肿瘤疫苗成为可能。最早进入临床试验的多肽疫苗是用于黑色素瘤的多肽疫苗, 在接受治疗的患者中大约10%30%会有一定的效果4。Rosenberg等5在一项研究中证实, 用黑色素瘤分化抗原gpl00的多肽疫苗和白细胞介素2(IL2)免疫16名黑色素瘤患者, 其中6名(38%)出现了肿瘤的缩小。陈红松等6研究发现, 肿瘤抗原NYESO1b多肽疫苗能够成功诱导部分中国肝癌患者特异的、 显著的抗肝癌免疫应答, 有效杀伤手术后残留的癌细胞, 降低手术后肝癌的转移和复发, 可能是一种有效的肝癌辅助治疗手段。肿瘤抗原NYESO1b多肽疫苗已经获得国家食品药品监督管理局批准进行期临床试验。 肿瘤肽疫苗的明显缺点是免疫原性太弱, 研究发现, HSP70可以在体外以非共价键的形式与多肽表位结合, 形成HSP70肽复合物, 也可以采用基因定点克隆的方法, 使多肽通过共价键结合于HSP70, 可更有效地激活T细胞, 极大地增强辅助性T细胞的功能, 从而提高表位疫苗的免疫效能。这两种方法均可激活CD8+T细胞, 产生多肽特异性的CTL反应, 而后者因不受肿瘤标本量的限制, 实用性更强7。本研究我们采用加端PCR方法将肝癌抗原肽EPVTKAEML的cDNA序列简便、 快捷的融合到HSP70的3末端, 经酶切鉴定及测序证实, 融合基因构建成功, 抗原肽EPVTKAEML与HSP70基因的开放读框正确, 并在大肠杆菌中表达出与预期Mr大小一致的蛋白, 该表达产物可用于抗肝癌多肽疫苗的研究。【参考文献】 1 郭爱林, 隋延仿, 叶 菁, 等. 一个新的MAGE1表位为肝癌细胞表面HLAB7分子递呈J. 中国免疫学杂志, 2001, 17(5): 252-255.2 曲 萍, 曹云新, 隋延仿, 等. human负载肝癌排斥抗原肽的树突状细胞瘤苗活化T细胞的应用J. 中国药理学通报, 2004, 20(4): 389-392.3 Parmiani G, Castelli C, Dalerba P, et al. Cancer immunotherapy with peptidebased vaccines: what have we achieved? Where are we going?J. J Natl Cancer Inst, 2002, 94(11): 805-818.4 Talebi T, Weber JS. Peptide vaccine trials for melanoma: preclinical background and cl